1. Какой лабораторный метод диагностики грибковой инфекции кожи наиболее чувствительный?
Микроскопическое исследование препарата, приготовленного путем обработки едким кали (КОН) материала соскоба с пораженного участка, является наиболее чувствительным методом лабораторной диагностики, при условии, что он проводится хорошо обученным персоналом. Исследование материала 220 соскобов как на культуру, так и путем обработки КОН дало положительный результат в обоих тестах в 45 % случаев, позитивный тест с КОН при отрицательном культуральном исследовании отмечался в 52 %, а положительный тест на культуру и отрицательный с КОН — только в 3 %. В других работах позитивное культуральное исследование сочеталось с отрицательным тестом с КОН чаще — в 5-15 % случаев. Однако надо учитывать, что точность диагноза при исследовании с едким кали зависит от опыта лаборанта.

2. Как проводится исследование с КОН?
Лучше всего выявление возбудителя проводить в материале, взятом с поверхности у края кольцевидных поражений. Поверхность нужно протереть ваткой, смоченной спиртом или водой, затем сделать соскоб с помощью лезвия № 15. Влажные роговые клетки легко переносятся с лезвия на стеклышко. В препарат добавляют 1-2 капли КОН (10-20 %) и накрывают покровным стеклышком. Препарат слегка подогревают, но не доводят до кипения, а затем микроскопируют. При просматривании материала фокус необходимо слегка изменять в одну и другую сторону таким образом, чтобы можно было обнаружить преломляющие свет гифы грибка (см. рисунок). Гифы грибка имеют правильные цилиндрические очертания, разветвления и септы. В более старых участках поражений обнаруживаются многочисленные споры, называемые артроспорами.

Гифы грибка, располагающиеся поперек препарата из соскоба кожи, обработанного КОН

3. Какие лабораторные тесты применяются для диагностики Tinea capitis?
Самым быстрым способом диагностики является использование лучей Вуда, вызывающих флюоресценцию в области поражения. Если отмечается желто-зеленая флюоресценция, то это свидетельствует о наличии грибковой инфекции. Однако отсутствие флюоресценции не исключает наличия Tinea capitis, поскольку Trichophyton tonsurans является возбудителем в 75-90 % всех случаев дерматомикоза волосистой части головы в США и не дает свечения в лучах Вуда. Более чувствительным и быстрым методом является исследование зараженного волоса, обработанного КОН.

Положительный тест на Tinea capitis с лампой Вуда. Светящиеся волосы — лучший материал
для исследования под микроскопом

Наилучшие результаты достигаются, когда исследуются обломанные волосы, поскольку они поражены гифами или артроспорами. Инфекция может быть выявлена сразу же, если грибы растут по поверхности волоса (эктотрикс) (см. рисунок на с. 29). Некоторые дерматофиты, такие как Т. tonsurans, растут внутри волоса (эндотрикс), и требуется несколько минут для того, чтобы КОН разрушил кутикулу волоса и артроспоры стали видны лучше.
Диагноз также подтверждается при получении культуры гриба. Для этого легко ломающиеся, инфицированные волосы вносят в питательную среду. Новой зубной щеткой можно также провести по пораженному участку волосистой части головы и затем приложить щетинку к поверхности питательной среды.

Поражение по типу эктотрикс в препарате, обработанном КОН. На поверхности волоса видны грибки

4. Что такое лучи, или лампа, Вуда? Насколько они полезны при диагностике кожных заболеваний?
Лампа Вуда испускает невидимое длинноволновое ультрафиолетовое излучение, или "черный свет", с длиной волны в 360 нм. При некоторых патологических нарушениях отмечается свечение, когда лучи Вуда направлены на поврежденную поверхность кожи или на собранную в сосуде мочу больного. Лучше всего это свечение наблюдать в абсолютно темной комнате.
Лампа Вуда облегчает диагностику ряда случаев Tinea capitis (Microsporum ssp. флюоресцируют, a Trichophyton spp — нет), разноцветного лишая (тусклое желтое свечение), эритразмы (кораллово-красное свечение) и инфекций кожи, вызываемых Pseudomonas (зеленое свечение). Она также используется в скрининговом тесте на позднюю кожную порфирию, при которой моча дает кораллово-красную флюоресценцию. Лампу Вуда используют и при некоторых нарушениях пигментации. У больных с гиперпигментацией она позволяет уточнить места расположения пигмента, поскольку усиливает цвет пигмента при нахождении его в эпидермисе, не действуя на пигмент, находящийся в дерме. При ультракоротковолновом облучении можно обнаружить различия между депигментацией и гипопигментацией у больных с гипопигментацией.

5. Какие питательные среды обычно используются для получения культуры дерматофитов?
"Dermatophyte test media" (DTM) и декстрозный агар Сабуро с антибиотиками или без них (например, агар "Mycosel"), являются наиболее распространенными средами для выращивания культур. Многие дерматологи предпочитают среду DTM, поскольку, благодаря наличию цветового индикатора, она меняет цвет в присутствии дерматофитов с желтого на красный. DTM позволяет отличить дерматофиты от недерматофитов в 95-97 % случаев обычно в течение первых двух недель проращивания. Декстрозный агар Сабуро является стандартным для микологических лабораторий и многих дерматологических кабинетов. Он состоит из декстрозы (источник энергии), пептона (источник белка) и агара (получение твердой поверхности). Для подавления сопутствующей микрофлоры добавляются антибиотики, а также циклогексамид, подавляющий рост дрожжей и недерматофитов. Чистый агар Сабуро является хорошей питательной средой для получения культуры Candida albicans.

6. Каким другим простым тестом (кроме обработки препарата КОН) можно выявить разноцветный лишай?
В связи с тем что возбудитель развивается на поверхности рогового слоя эпидермиса, прекрасным диагностическим тестом является прямой метод "целлофановой ленты". Сначала производится поскабливание кожи для получения достаточного количества чешуек. Затем лента накладывается на чешуйки и помещается на стеклышко для исследования под микроскопом. Пучки коротких гифов и дрожжей создают картину "спагетти с мясными шариками". Для селективного окрашивания возбудителя в препарат можно добавить метиленовый синий (см. рисунок).

Позитивная проба методом "целлофановой ленты" при разноцветном лишае с окраской метиленовым синим

7. Что такое проба Тцанка?
Проба Тцанка является стандартным методом быстрой диагностики инфекций, вызванных вирусом простого герпеса и вирусом Varicella-zoster. Метод не позволяет различить эти два возбудителя и определить подтипы вируса простого герпеса.

Положительная проба Тцанка с наличием в препарате больших многоядерных акантолитических кератиноцитов. Ядра нормальных кератиноцитов по величине близки к размерам нейтрофилов, которые также видны в этом препарате

Лезвием скальпеля поскабливается основание свежего пузыря с последующим распределением прилипших клеток и субстрата на поверхности тонкого стеклышка. Затем производится окраска по Гимза, Райту или Седи. При микроскопии выявляются гигантские клетки атипических кератиноцитов с большими ядрами (см. рисунок).

8. Насколько точна проба Тцанка при диагностике пузырьковых вирусных высыпаний?
Чувствительность метода зависит от стадии, в которой находится пузырек. В одном из исследований указывалось, что результат пробы был положительным в 67 % случаев при наличии пузырьков, в 54 % — гнойничков и в 16 % — покрытых корками поражений, вызванных вирусом простого герпеса. Пробы Тцанка положительны в 80 % случаев с клинической картиной поражения, вызванного вирусом Varicella-zoster.

Сравнительная чувствительность методов Тцанка, полимеразной реакции синтеза цепи (ПРСЦ) и получения культуры
 

9. Каков лучший метод для диагностики чесотки?
Наилучшим методом является соскабливание чесоточного хода и обнаружение клеща внутри него. Классический чесоточный ход выглядит как неравномерное, линейное, слегка возвышенное поражение, легче всего обнаруживаемое на сгибательных поверхностях запястий, в межпальцевых промежутках и на коже половых органов. В 85 % случаев заболевания у взрослых мужчин можно обнаружить клещей на кистях или запястьях. Иногда клещ виден невооруженным глазом как маленькая точка на одном из концов хода. Материал берется с помощью лезвия скальпеля. После смазывания минеральным маслом либо лезвия, либо кожи пациента производится поскабливание в области хода (однако не столь сильное, чтобы вызвать кровотечение). Минеральное масло собирается с кожи и переносится на стеклышко, которое затем микроскопируется. Диагноз ставится при обнаружении самого клеща, его яиц или экскрементов (см. рисунок).

Материал соскоба на чесотку с виднеющимся взрослым клещом, его яйцами и множественными комочками экскрементов

10. Как диагностировать укусы клещей, попавших к человеку от животных?
У пациента отмечаются зудящие красные волдыри, наиболее часто расположенные на руках, грудных железах и животе. Как правило, источником таких клещей являются кошки, зараженные Cheyletiella. Эти не делающие ходов клещи придерживаются тактики "укусил и убежал", и поэтому их трудно обнаружить на теле больного. Основой для постановки диагноза является обследование кошки ветеринаром, знакомым с данным видом паразитов. Диагноз устанавливается при обнаружении в препарате, полученном методом "целлофановой ленты", личиночных форм клеща с шестью лапками или взрослых особей — с восемью лапками. В отличие от чесоточного клеща, Cheyletiella имеет хорошо развитые и похожие на клешни части ротового аппарата.

11. Какой диагностический тест необходимо провести пациенту с шанкром на половом члене, напоминающим сифилитический?
Исследование "в темном поле" материала из шанкра является самым специфическим тестом для диагностики сифилиса. Он дает положительный результат, если только пациент не применял местно или внутрь антибиотиков. Кроме диагностики первичного сифилиса, микроскопия "в темном поле" используется в диагностических целях при всех поражениях кожи и слизистых при вторичном сифилисе. При исследовании материала, взятого со слизистых рта или прямой кишки, тест менее надежен в связи с широкой распространенностью в этих местах сапрофитной непатогенной трепонемы, иногда ошибочно принимаемой за возбудителя сифилиса.
Наилучшим материалом для исследования "в темном поле" является серозная жидкость, выжимаемая из основания язвы после очистки ее с помощью стерильного физиологического раствора и марли. Взятый материал должен немедленно проверяться на наличие микроорганизмов с характерной штопорообразной конфигурацией и колебательными движениями. Если у пациента подозревается сифилитический шанкр, а исследование "в темном поле" не дало результата, его повторяют по крайней мере еще один раз, прежде чем исключить диагноз. Исследование "в темном поле" — дешевый и дающий немедленный результат тест. Однако его подчас невозможно провести. Вместо него можно выполнить микроскопию с флюоресцирующими антителами, являющуюся чувствительным методом. К важному преимуществу метода относится возможность исследования и неживых микроорганизмов в фиксированных препаратах. Для этого используются антитела к Т. pallidum. Метод не требует сложного анализа ввиду высокой специфичности антител, но не всегда доступен.

12. Как диагностируется вторичный сифилис?
Как и при первичном сифилисе, самым специфичным методом диагностики является микроскопия "в темном поле" или специальное окрашивание биоптатов кожи. Чаще назначаются такие скрининговые тесты на сифилис, как нетрепонемные серологические тесты, реагинная экспресс-проба и тест Научно-исследовательской лаборатории по изучению венерических заболеваний (VDRL-тест). В этих тестах определяются антитела на реагин, холестерол-лецитин-кардиолипиновый антиген, дающий перекрестную реакцию с антителами сыворотки крови больных сифилисом. Поскольку эти антитела не специфичны для сифилиса, диагноз должен быть подтвержден специфическим тестом - РИФ-абс. (пробой с абсорбцией флюоресцирующих спирохетозных антител) — или тестом на микрогемагглютинацию Т. pallidum.
Нетрепонемные серологические тесты на сифилис положительны почти во всех случаях вторичного сифилиса. Ложноотрицательные реакции иногда наблюдаются у пациентов с очень высоким титром антител; этот феномен "прозоны" может быть устранен разведением сыворотки больного. Указанные тесты оцениваются по титрам. Адекватное лечение приводит к снижению титров или негативации реакции. Если пациент, инфицированный ВИЧ, заражается сифилисом, показатели реагиновой экспресс-пробы у него обычно значительно выше. Изредка у инфицированных ВИЧ наблюдались отрицательные серологические реакции при первичном и вторичном сифилисе.

13. Насколько эффективнее окраска экссудата по Граму по сравнению с получением культуры гонококка на селективных средах при наличии симптомов гонококкового уретрита?
Окраска по Граму выделений из уретры при наличии симптомов гонореи у мужчин является отличным методом диагностики. Позитивная окраска по Граму, выявляющая многочисленные нейтрофилы, отдельные из них содержат скопления грамотрицательных диплококков, обращенных более сглаженными сторонами один к другому, оказывается чувствительной в 98 % случаев заражения. По сравнению с данным методом, получение культуры является дорогостоящей процедурой, мало что добавляющей к диагностике (около 2 %).
Культуральные исследования обычно производятся у мужчин с уретритом и отрицательным или непоказательным результатом окраски по Граму выделений из уретры. При подозрении на гонорею у женщин материал для анализа берут со слизистой оболочки канала шейки матки. Однако мазки, окрашенные по Граму, не чувствительны (30-60 %) и трудны для интерпретации, поэтому необходимо культуральное исследование с применением селективной среды.

14. Какой способ является лучшим при диагностике аллергического контактного дерматита?
Метод выбора — правильно примененная и интерпретированная аппликационная кожная проба. Контактные дерматиты подразделяются на аллергические и возникающие вследствии раздражения. Контактный дерматит от раздражения не затрагивает иммунные механизмы, а обусловлен химическим повреждением кожи (действие на кожу кислоты из аккумулятора или постоянная стирка вручную, с чем сталкивался почти каждый). Аллергический дерматит опосредован иммунологически и является проявлением приобретенной повышенной чувствительности, которая отмечается не у всех.

15. Как проводят накожные аппликационные пробы?
Вещество, которое, как полагают, вызвало аллергию, добавляют в соответствующий растворитель, добиваясь требуемой концентрации. Аллергены для накожной пробы существуют в готовой форме, а менее распространенные аллергены могут быть приготовлены для каждого конкретного случая. Аллергены помещаются в ячейки, которые затем прикрепляются к коже спины пациента на 48 ч. Данный участок кожи осматривают через 24-72 ч после снятия наклейки. Выраженная положительная реакция проявляется в виде эритемы, инфильтрации, узелков и пузырьков. Образование пузыря свидетельствует о крайней степени выраженности реакции. Интерпретация результатов теста и выявление их связи с клиникой заболевания сложна и обычно доступна только дерматологу.

16. При каких заболеваниях проводят биопсию кожи?

Биопсия кожи с обычной окраской гематоксилин-эозином — клинический диагностический метод при многих новообразованиях кожи, которые невозможно диагностировать визуально. Она также эффективна при воспалительных заболеваниях, особенно в тех случаях, когда специфический диагноз трудно поставить по клинической картине, данным анализов крови или соскобов кожи. Материал, полученный при биопсии, исследуют методами иммунофлюоресценции и электронной микроскопии, подвергают специальной окраске, культуральному анализу.

17. В каких случаях показана "бритвенная" биопсия?
Выбор метода биопсии требует знания базовой дерматологии, т. е. понимания того, где вероятнее всего локализован очаг патологии. Бритвенная биопсия, как правило, является самой поверхностной из биопсий и особенно ценна, когда поражен эпидермис или зона, прилегающая к нему. Этот метод чаще всего используют при исследовании образований, имеющих ножку, папулезных и других поражений, возвышающихся над поверхностью кожи и особенно при диагностике базально-клеточной и плоскоклеточной карциномы, себорейного кератоза, бородавок, интрадермального невуса и пиогенной гранулемы. При большинстве воспалительных заболеваний подобный метод биопсии малоэффективен.

18. Каковы показания для пункционных биопсий?
При пункционной биопсии круглым ножом вырезается участок кожи, включая эпидермис, дерму и необходимое количество подкожной жировой клетчатки, в виде цилиндра. Хотя при пункционной биопсии можно захватывать участок ткани от 2 до 10 мм в диаметре, обычно его диаметр составляет 4 мм. При необходимости проведения дополнительно культуральных и других исследований наиболее приемлемый диаметр пробы — 6 мм. Изготовление срезов предпочтительнее начинать со стороны дермы, чтобы по возможности избежать артефактов от сдавливания ткани. Пункционная биопсия с диаметром в 6 мм полезна при диагностике грибовидного микоза, Т-клеточной лимфомы кожи и в случаях, когда необходимо получить достаточное число фолликулов в биоптате с волосистой части головы. В связи с имеющейся возможностью относительно легкого изменения направления пункционной биопсии (обычно на 3-4 мм) она является методом выбора при последующем проведении иммунофлюоресцентного анализа. Образовавшийся дефект ткани можно оставить для спонтанного заживления, однако большинство дерматологов закрывают дефект одним швом.

19. Каковы показания для эксцизионной и инцизионной биопсии?
Эксцизионная и инцизионная биопсии отличаются от пункционной биопсии большей глубиной и овальной формой удаляемого кусочка ткани. Эксцизионная биопсия включает полное (до уровня подкожного жира) удаление патологического образования с последующим послойным закрытием раны кожи. Способ особенно эффективен при полном удалении опухолей, таких как злокачественная меланома, базально-клеточная и плоскоклеточная карцинома. Эксцизионную биопсию производят, если предполагается, что после нее косметический эффект будет лучше, чем после пункционной. Инцизионная биопсия — это неполное или частичное удаление патологического образования до подкожного жира с последующим послойным ушиванием кожи. При подозрении на меланому, которая слишком велика, чтобы быть удаленной обычным хирургическим вмешательством, производится инцизионная биопсия с удалением самой толстой части меланомы для проведения диагностических исследований. Такой тип биопсии эффективен для диагностики панникулита, склеротических или атрофических поражений, при которых необходимо сравнить кожу в очаге поражения с кожей прилегающих нормальных участков (например, при склеродерме), а также в случаях поражений с активно расширяющимися границами, таких как гангренозная пиодермия.

20. Дайте определение и опишите метод прямой иммунофлюоресценции, применяемый в дерматологии.
Метод прямой иммунофлюоресценции заключается в гистологической окраске на антитела или другие белки в тканях, взятых при биопсии кожи. Кусочек ткани (кожи), взятый у больного, сразу же замораживается в жидком азоте или помещается в специальную среду для сохранения иммунореактантов. В лаборатории, проводящей данный анализ, делаются срезы, которые затем инкубируются вместе с антителами и человеческим иммуноглобулином или компонентами комплемента, меченными флюорохромом для визуализации последних. Препараты исследуются методом флюоресцентной микроскопии; при этом свечение указывает на имевшееся отложение иммунореактантов в тканях. Заболевание определяют по наличию характерных специфических иммунореактан гов, типу и интенсивности свечения.

21. Назовите заболевания кожи, при которых метод прямой иммунофлюоресценции помогает поставить диагноз.
Многие иммунологические заболевания, сопровождающиеся появлением пузырей, характеризуются специфическими изменениями, выявляемыми методом прямой им-мунофлюоресценции. Эти заболевания включают буллезный пемфигоид, герпес беременных, рубцующий пемфигоид, приобретенный буллезный эпидермолиз, герпети-формный дерматит, линеарный IgA-буллезный дерматоз и различные типы пузырчатки. Кроме того, метод полезен при оценке кожной и системной форм красной волчанки, других коллагеновых сосудистых заболеваний, васкулитов типа Шенлейна-Геноха и некоторых порфирий.