Учебное пособие: Определение уровня естественной резистентности и оценке иммунного статуса рыб

- Получение гемолизина.

- Рыба. Для иммунизации используют неполовозрелую рыбу из благополучного хозяйства. Рыбу предварительно адаптируют и содержат в условиях
наиболее оптимальных для каждого вида (температура воды, проточность,
аэрация, полноценное кормление).

- Приготовление стромы эритроцитов барана. 100 мл крови барана в растворе
Олсвера (1:1) центрифугируют при 500-1000 g 10 мин (+ 4° С) и дважды отмывают
200 мл физраствора. Осадок эритроцитов лизируют в 1 л дистиллированной воды,
содержащей 0,4 мл ледяной уксусной кислоты, в течение ночи при +4° С.
Центрифугируют, затем осадок стромы промывают б раз 0,0б1 М ацетатным
буфером (рН 5,0) и 1 раз физраство-ром, центрифугируя 20 мин. при 500-1000 g.
Осадок тщательно ресус-певдируют в 30 мл физраствора. В суспензии определяют
содержание азота микромстодом Кьельдаля и доводят концентрацию до 1 мг/мл.
- Иммунизация рыб. Рыбу инъецируют в/б суспензией стромы эритроцитов
из расчета 0,3-0,5 мг n/кг массы рыбы. Инъекций повторяют многократно (6-8 раз)
с интервалом 5 дней. Перед каждой инъекцией (начиная с 4-5) отбирают
сыворотки и определяют титр гемодизина. Количество инъекций зависит от титров
полученных гемолйзинов (определение тетрагемолизина см. ниже).
- Отбор антисывороток и условия хранения. Через 5 дней после последней
инъекции стерильно отбирают максимальное количество крови. После
образования и ретракции сгустка центрифугируют 5 мин при 1500 g. Отбирают
сыворотки и разводят 1:1 gvb2^ инактивируют прогреванием (карповые-20 мин
при 50° С, лососевые - 20 мин при 42-45°С), расфасовывают и хранят при -20° С и
ниже.
- Определение титра гемолизина. Готовят серийные 2-х кратные разведения
антисывороток gvb2^ К 0,5 мл каждого разведения антисыворотки добавляют по
0,1 мл эритроцитов барана (1х109 кл/мл, см. ниже), по 0,4 мл gvb 2+ и по 0,5 мл
комплемента, разведенного gvb2^ 1:20-1:40 (в качестве комплемента используют
свежую сыворотку, полученную от интактных рыб того же вида). Смесь
инкубируют при 20 - 25° С в зависимости от вида рыб (карповые - 25°С - 60 минут,
лососевые - 20° -120 минут), центрифугируют 5 минут при 1600 g, определяют
оптическую плотность (od541) супернатанта и рассчитывают степень гемолиза. За
титр гемолизина принимают разведение, дающее 50 % гемолиз.
- Получение и условия хранения комплемента. Комплемент рыб очень
термолабилен и быстро инактивируется даже при 0° С (несколько часов), не
переносит замораживания при минус 20° С, при минус 35° С активность
сохраняется в течение месяца. Кровь после отбора оставляют на 30 мин при комнатной температуре, затем на 1 час при 0°С (лед с водой) для ретракции сгустка, центрифугируют 5 мин при 1500 g (0° ...+4° С) и отбирают сыворотки. Сыворотки как источник комплемента используют немедленно, а при необходимости хранят при -80° С или
лиофилизируют.

- Приготовление суспензии эритроцитов. Эритроциты барана в растворе
Олсвера (1:1) трижды отмывают edta-gvb и готовят 5% суспензию в gvb2^ К
0,1 мл 5 % суспензии эритроцитов добавляют 1,4 мл дистиллированной воды,
после лизиса эритроцитов измеряют ods4i против дистиллированной воды.
Необходимой концентрации эритроцитов барана 1х109 кл/мл соответствует 0d541
0,680 при длине оптического пути 1 см. Если 5 % суспензия не дает необходимого
значения od541, значит ее необходимо развести (если od541<0,680) или
сконцентрировать (если od541>0,680) во столько раз, во сколько полученное
ods4i отличается от 0,680.

- Подбор разведения гемолизина для оптимальной сенсибилизации
эритроцитов. Готовят серийные двукратные разведения гемолизина (используют
гемолизин с титром 1:1500 и выше) на gvb2'. Берут 2-4 ряда пробирок. В каждый
ряд вносят по 0,1 мл/пробирку приготовленные разведения гемолизина. Во все
пробирки добавляют по 0,1 мл суспензии эритроцитов. Встряхивают и
инкубируют при 25° С 20 мин. Готовят несколько разведении комплемента на
gvb24 - на каждый ряд свое разведение. Величина разведения зависит от вида рыб
и активности комплемента (1:15 - 1:80). В каждую пробирку ряда вносят по 1,3 мл
комплемента одного и того же разведения. Инкубируют 60 мин при 25° С (для кар-
па), 120 мин при 20° С (для лососевых), 120 мин при 25° С (для тиляпии),
периодически встряхивая. Центрифугируют 5 мин при 16ДО g, определяют od541
и рассчитывают процент гемолиза супернатанта для каждой пробирки. Для
каждого разведения комплемента строят график зависимости процента гемолиза от
разведения гемолизина. Выбирают кривую с таким разведением комплемента, при котором максимальный гемолиз составляет 50-70% (т.е. кривая выходит на плато при
гемолизе 50-70%). За оптимальное разведение гемолизнна принимают
максимальное разведение, вызывающее максимальный % гемолиза (выход кривой
на плато) и для надежности это разведение уменьшают в 2 раза (например, кривая
выходит на плато при разведении гемолизина 1:800, а за оптимальное принимают
разведение 1:400).

- Приготовление сенсибилизированных эритроцитов. Готовят оптимальное
разведение гемолизина в edta-gvb. Это разведение медленно добавляют (при
постоянном помешивании) к равному объему суспензии эритроцитов (1х109 кл/мл
в edta-gvb) и инкубируют 30 мин при 25° С. Сенсибилизированные эритроциты
отмывают в ggvb2^, центрифугируют 5-10 мин при 500g и готовят суспензию
эритроцитов в ggvb^ с концентрацией 5х108 кл/мл. Концентрацию эритроцитов
контролируют, измеряя ods4i лизированных клеток (0,2 мл суспензии
сенсибилизированных эритроцитов + 1,3 мл дистиллированной воды дают ods4i,
равную 0,680). Сенсибилизированные эритроциты хранят при +4° С в течение 1
недели.
- Техника постановки реакции и расчет активности комплемента. Все
компоненты реакции смешивают при 0° С (лед с водой). Испытуемый комплемент
разводят gvb24 в зависимости от предполагаемой его активности, чтобы попасть в
область 50% лизиса (для карпа обычно 1/40 - 1/60, для лососевых - 1/60 - 1/80).
Берут ряд из 8 пробирок. В 5 пробирок вносят разные объемы разведенного
испытуемого комплемента (0,4; 0.5; 0.6; 0.8; 1.0 мл), gvb21 доводят объем до 1,3
мл, в каждую пробирку добавляют по 0.2 мл сенсибилизированных эритроцитов.
Три пробирки используют для контролей: 1 -контроль эритроцитов на спонтанный
лизис (0.2 мл сенсибилизированных эритроцитов + 1.3 мл gvb^); 2 - 100% лизис
эритроцитов (0.2 мл суспензии сенсибилизированных эритроцитов + 1.3 мл
дистиллированной воды); 3 - контроль od.541 комплемента (1.0 мл разведенного
комплемента + 0.5 мл gvb^).

Пробирки инкубируют, периодически встряхивая (время и температура -
оптимальные для каждого вида рыб). Центрифугируют 5 мин при 1600g. Измеряют
od541 супернатанта. Вычисляют степень гемолиза (у) с учетом поправок на
контроли. Т.е. от полученного значения od.,41 супернатанта каждой опытной
пробирки вычитают od.s4i контроля эритроцитов и ods4i контроля комплемента
(значение ods^i контроля комплемента измеряют только для первой пробирки, в
которой максимальный объем комплемента, а для остальных пробирок эта
величина уменьшается пропорционально уменьшению объема комплемента).

В логарифмическом масштабе строят график зависимости у/(1 - у) от объема
комплемента. При 50% гемолизе у/(1 - у) = 1. Графически находят объем
комплемента (К), вызывающий 50% гемолиз, что соответствует 1 гемолитической
единице chso Количество СН5о в 1 мл (М) рассчитывают по формуле:

 
М = 0.2 n : К,

 где: n - величина, обратная разведению комплемента; 0.2 - коэфф. коррекции, т.к. в используемом варианте объем реакционной смеси в 5 раз меньше (1.5 мл), чем в оригинальном по Мейсру (7.5 мл). Гемолитическая активность комплемента карпа равна 20.0 ± 9.1, радужнойфорели - 28.0 ± 13.5, тиляпии - 205.1 ± 76.6. (t.yano, 1992).

2.2.2.2. Определение гемолитической активности комплемента по
альтернативному пути активации (по yano Т., 1992).

Для определения активности комплемента по альтернативному пути обычно
используют эритроциты кролика, как активатор и тест-объект. Реакцию ведут в
присутствии egta (хелатньш агент для Са2^ чтобы блокировать классический
путь активации) и mg2+.

Гемолитическая активность карпа (в отличие от радужной форели, тиляпии,
аю, порги, ' желтохвоста, человека, свиньи) возрастает в несколько десятков раз
при добавлении в реакционную смесь 0.1 mm ca2^
- Принцип метода основан на способности комплемента активироваться
эритроцитами кролика и лизировать их.
За единицу активности комплемента (АСН5о) принимают такое количество
неразведенной сыворотки, которое вызывает 50% лизис 4х10 эритроцитов при
20°С в желатин-вероналовом буфере, содержащем 10mМ egta и 10mm mg^ в
объеме 0.7 мл; рН и время инкубации различаются в зависимости от вида рыб
(радужная форель - рН 7.0, 1.5 часа; карп - рН 7.5, 1.5 часа).
- Оборудование и реактивы; оборудование см. п. 2.2.2.1.; глюкоза;
дистилированная вода; Ма-5,5-диэтилбарбитурат; mgcl2+2; in hc1;
egta; желатин; naoh; эритроциты кролика; сыворотка крови рыб (источник
комплемента).

- Приготовление буферных растворов:

- Всроналовый буфер, концентрат (5 vb), см.п, 2.2.2.1.
- 0,1 М egta - mg буфер,: egta - 38 r, mgc12 x 6 Н20 - 20,3 г, naoh – 7
r, дистилированная вода - 1л, доводят рН до 7,5 in naoh.
- 0,01 М egta - mg желатин-вероналовый буфер (egta-mg-gvb):
жедатин-0,1 г; 5 vb-20 мл; 0,1 М egta-mg-10 мл; дистилированная вода до 100
мл, доводят рН до 7,5 (для карпа), до 7,0 (для радужной форели). Хранят при +4° С
в течение 1 недели.

- Приготовление суспензии эритроцитов кролика. Эритроциты кролика в
растворе Олсвера (1:1) отмывают трижды в egta-mg-gvb и готовят суспензию с
концентрацией 2х108 кл/мл в этом же буфере. Концентрацию эритроцитов
контролируют, измеряя odw лизированных клеток (к 0,1 мл суспензии
эритроцитов добавляют 3,4 мл дистиллированной воды и измеряют od4i4 лизата;
если полученная величина od4i4 отличается от 0,740, то суспензию эритроцитов
необходимо развести или сконцентрировать во столько раз во сколько полученное
00414 отличается от 0,740).

-Получение и условия хранения комплемента см.п.2.2.2.1.
-Техника постановки реакции и расчет активности комплемента. Все
компоненты реакции смешивают при 0° С (лед с водой). Испытуемый комплемент
разводят в egta-mg-gvb в зависимости от вида рыб и предполагаемой
активности (для карпа 1/15 - 1/20, радужной форели 1/100 -1/170).
Берут ряд из 8 пробирок. В 5 пробирок вносят разные-объемы разведенного
комплемента (0,1; 0,125; 0,160; 0,20; 0,25 мл), доводят общий объем до 0,25 мл
egta-mg-gvb и добавляют в каждую пробирку по 0,1 мл суспензии эритроцитов.
Три пробирки используют для контролей: 1-контроль эритроцитов на спонтанный
лизис (0,25 мл egta-mg-gvb + 0,1 мл суспензии эритроцитов); 2 - 100 % лизис
(0,1 мл суспензии эритроцитов + 3,4 мл дистиллированной воды); 3 - контроль
комплемента (0,25 мл разведенного комплемента + 0,1 мл egta-mg-gvb).
Пробирки инкубируют 90 мин при 20° С (для карпа, радужной форели),
периодически встряхивают.

В каждую пробирку (кроме 2-го контроля) добавляют по 3,15 мл egta-mg-
gvb и центрифугируют 5 мин. при 1600g. Измеряют od4i4. Вычисляют степень
гемолиза (у) с учетом поправок на контроль эритроцитов и комплемента
(см.п.2.2.2.1.). В логарифмическом масштабе строят график зависимости у/1-у от
объема комплемента. При 50 % гемолизе у/(1-у)=1. Графически находят объем
комплемента (К), вызывающий 50 %-ньш гсмолиз, что соответствует одной
гемолитической единице АСН5и.
Количество АСН5о в 1 мл (М) рассчитывают по формуле:

М = 0,5 n : К,

 где: n-величина обратная разведению комплемента, 0,5- коэфф. коррекции, т.к. в
используемом варианте объем реакционной смеси в 2 раза меньше, чем в
оригинальном. По данным yano Т., 1992, гемолитическая активность комплемента
карпа равна 58,9 j: 13,5, радужной форели - 345 +_ 108, тидяпии- 574 j: 250, барана
- 15,4, морской свинки - 11,9, собаки -14,4, человека -18,4.

2.2.3. Определение активности иптерферона спектрофотометри-ческим
методом (t.renault et al. 1991, с дополнением)

Разработано несколько методов определения активности интерфе-рона,
основанных на его способности ингибировать ЦПД вируса в культуре клеток,
снижать число бляшек в ней, подавлять титр вируса и синтез РНК. Титром
интерферона считают наибольшее разведение испытуемого материала,
уменьшающее на 50% показатель активности вируса в контроле. При
исследовании большого количества образцов часто используют микрометод
титрования интерферона в культуре клеток. При этом очень важно выбрать
соответствующую систему "культура клеток - вирус". Вирус должен иметь
высокую чувствительность к интерферону и вызывать в культуре клеток четкие
изменения, приводящие к разрушению монослоя. Используют культуру клеток
гомологичную интерферону и высоко чувствительную к его защитному действию.
Для титрования интерферона лососевых рыб наиболее распространенной является
система: rtg-2-ipnv; ддя карпа - ЕРС- svcv. В качестве источника интерферона
используют сыворотки рыб, в случае исследования мальков - го-могенат тушек
рыб.

2.2.3.1. Принцип метода. Спектрофотометрический микрометод титрования
интерферона основан на различии оптической плотности ин-тактного клеточного
монослоя и монослоя с признаками ЦПД после окрашивания соответствующими
красителями. За единицу активности интерферона принимают такое разведение
образца, которое защищает 50% клеточного монослоя, то есть оптическая
плотность клеточного монослоя, обработанного этим разведением, равна 50%
оптической плотности контрольного неинфицированного монослоя.

2.2.3.2. Оборудование и реактивы: фотометр для работы с 96-луночными
микропанелями (ридер); дозирующие микропипетки (1- и 8-канальные на 0,2 мл);
96-луночные культуральные микропанели; СС>2 - инкубатор или термостат с
эксикатором и со свечкой; инвертированный микроскоп; стерильная фильтровальная бумага; вирус; культура клеток; ростовая и поддерживающая
среды, необходимые для выбранной культуры клеток (ростовая среда содержит
10% сыворотки, поддерживающая - 2%); 1%-ный раствор кристаллвиолета в 20%
этанояе.

2.2.3.3. Подготовка образцов интерферона к исследованию. Сыворотки
получают общепринятым способом. Гомогенат готовят на поддерживающей среде
в соотношении 1:4. Центрифугируют 15 мин при 3500g и собирают супернатант.
Сыворотки или супернатант освобождают от вируса (если его использовали в
качестве индуктора интерферона) одним из" способов: прогреванием (время и
температура зависят от использованного вируса; vhsv - 30 мин при 45° С );
ультрацентрифугированием - 4 часа при looooog ; низким рН (добавляют НС1
до рН 2,0, выдерживают 24-48 часов при +4° С, восстанавливают рН до 7.0 добав-
лением naoh).

Если в качестве индуктора использовали дсРНК или другие препараты (но не
вирусы), эта процедура исключается. Содержащие интерфе-рон образцы можно
хранить при -20° С и ниже.

2.2.3.4. Подготовка рабочей дозы вируса. Вирус накапливают в наиболее
чувствительной культуре клеток и титруют методом серийных 10-кратных
разведении. Готовят вируссодержащую суспензию в поддерживающей среде с
титром 4х103 БОЕ/0.2 мл для системы rtg-2 - ipnv и 100 ТЦД5о/0,2 мл для
системы epc-svcv.

2.2.3.5. Подготовка суспензии клеток. Суспензию клеток готовят в ростовой
среде с такой концентрацией клеток, чтобы через сутки образовался монослой
(rtg-2 - 95х103 клеток/О. 1 мл; ЕРС - 80-85х103 клеток/О. 1 мл).

2.2.3.6. Техника титрования ингерферона. Восьмиканальной микропипеткой
готовят 2-кратные разведения образцов интерферона на ростовой среде в 96-
луночной микропанели (для каждого разведения используют 3-4 лунки) по 0,1
мл/лунка. Чтобы исключить неспецифическое и токсическое действие образцов,
титрование начинают с разведения 1:8, а количество разведении зависит от
предполагаемого титра интерферона. Обычно достаточно конечного разведения
1:1024.

В качестве контролей используют: 1 - контроль клеток (в 3-4 лунки вносят по
0.1 мл ростовой среды); 2 - контроль на токсичность образца (в 3-4 лунки вносят
по 0.1 мл образца, разведенного 1:8); 3 - контроль рабочей дозы вируса (в 6-8
лунок вносят по 0.1 мл ростовой среды).
Во все лунки (опытные и контрольные) вносят по 0,1 мл суспензии клеток.
Микропанели закрывают крышкой и помещают в СОг-инкубатор при температуре,
оптимальной для роста культуры клеток (20° С для rtg-2, 25° С для ЕРС). При
отсутствии СО; - инкубатора можно использовать эксикатор, в который помещают
микропанели, зажигают свечу, закрывают крышку и ставят в термостат с
указанной температурой. Для герметизации края крышки эксикатора обмазывают
вазелином. Через 18-20 час инкубации микропансли открывают, переворачивают и
аккуратно стряхивают, чтобы удалить среду. Края панели промокают стерильной
фильтровальной бумагой. Во все подопытные лунки и лунки контроля рабочей дозы вируса вносят по 0.2 мл рабочей дозы вируса. В лунки контролей 1 и 2 вносят по 0,2 мл
поддерживающей среды. Микропанели закрывают и помещают в СО-г - инкубатор при температуре, оптимальной для репродукции вируса. Инкубируют до развития ЦПД на 100% в лунках с контролем рабочей дозы вируса.

2.2.3.7. Учет результатов и расчет активности интерферона.

Среду из микропанслсй удаляют стряхиванием, клетки окрашивают в
течение 10 мин 1%-нь1м раствором кристаллвиолета в 20%-ном этаноле.
Краситель удаляют, а клетки промывают 3 раза водой и высушивают.
Краситель элюируют 70%-ным этанолом (0.1 мл/лунку) и определяют od595.
Можно определять оптическую плотность клеток без элюиро-вания, сразу после
высушивания. Рассчитывают среднее значение od595, для лунок с контрольными
клетками (odmax), с рабочей дозой вируса, т.е. при 100% поражении монослоя
(odmin), а также среднее значение od595 для каждого разведения интерферона.
Оптическую плотность образцов при 50% защите клеток определяют по
формуле:
od5o = (odmax - odmin):2

Количество единиц активности интерферона в 1 мл образца (Аиф ) рассчитывают по формуле:
Аиф= 1/vtn + [(Т n+1 - tn) x (odn - odmin - od5o):(odn - odn+1 v - объем образца, 0.1 мл;
t,i -величина, обратная разведению образца, дающему больше 50% защиты
клеток от инфекции; Т пн - величина, обратная разведению образца, дающему меньше 50% защиты клеток; odn - оптическая плотность образца, защищающего больше 50% клеток; od,n+1 - оптическая плотность образца, защищающего меньше 50% клеток.

При отсутствии фотометра долю непораженных клеток в каждой лунке (в
процентах) определяют приблизительно, исследуя микропанель под
инвертированным микроскопом. Активность интерферона рассчитывают по этой
же формуле, подставлял вместо величины оптической плотности долю
непораженных клеток (в процентах). Специфическая иммунная система
Специфическая иммунная система состоит из клеточных и гуморальных
компонентов. От неспецифических факторов они отличаются специфичностью
взаимодействия с чужеродными агентами. Специфичность иммунных реакции
определяется лимфоцитами и иммуноглобули-нами.
Состояние специфического звена иммунной системы рыб важно знать при
оценке иммунного статуса, определении потенциальных возможностей организма
рыб противостоять воздействию агрессивных факторов среды и установлении
характера влияния иммуномоду пирующих к вакцинных средств. Оно оценивается
по данным анализа клеточных и гуморальных факторов иммунитета.

Страницы: 1, 2, 3