Ретинальсодержащий белок
(хромофор -
протонированный альдемин ретиналя с e-аминогруппой Lys-216) - бактериородопсин (БR) выполняет функции АТФ-зависимой
транслоказы в клеточной мембране галофильных бактерий Halobacterium halobium
[1]. Несмотря на его структурно-функциональную изученность, он остается в
центре внимания биотехнологии из-за своей высокой светочувствительности и
разрешающей способности и используется в прикладных целях как биологический
фотохромный материал [2]. БR также привлекателен, как модельный объект для
изучения функциональной активности и структурных свойств мембранных белков в
составе искусственно сконструированных энергопреобразующих мембран [3].
Для целого ряда
структурно-функциональных исследований с БР целесообразно вводить в молекулу
белка изотопную метку дейтерия, позволяющую использовать для последующего
анализа изотопного включения метод высокочувствительной масс-спектрометрии
электронного удара [4, 5]. Поэтому большое научно-прикладное значение имеет БR,
меченный дейтерием по остаткам функционально важных ароматических аминокислот - фенилаланина, тирозина и триптофана,
участвующих в гидрофобном взаимодействии полипептидной цепи белка с липидным
бислоем клеточной мембраны [6]. 2Н-меченые ароматические
аминокислоты могут быть синтезированы с препаративными выходами методом
обратного изотопного обмена (1Н-2Н) в молекулах
протонированных аминокислот - [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланин в 85% 2H2SO4
при 500C, [3, 5-2H2]тирозин в 6 н. 2H2SO4
при слабом кипячении реакционной смеси, [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофан
в 75% 2H-меченой трифторуксусной кислоте при 250С [7, 8].
Однако несмотря на изученность современных методов химического синтеза 2Н-меченых
ароматических аминокислот, отечественная индустрия индивидуальных 2Н-меченых
мембранных белков не получила необходимого развития.
В настоящей работе
осуществлен биосинтез БР, меченного дейтерием по остаткам [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланина,
[3, 5-2H2]тирозина и [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана
для реконструкции искусственных мембран с последующим микропрепаративным
выделением, а также исследован уровень дейтерированности молекулы БР методом
масс-спектрометрии электронного удара метиловых эфиров
N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных (Днс)-производных аминокислот с обращенно-фазовой
ВЭЖХ.
Выбор стратегии
биосинтеза 2Н-меченого БР c использованием штамма экстремальной
галофильной бактерии Halobacterium halobium определялся целью
исследования, связанной с изучением принципиальной возможности получения 2Н-меченых
препаратов мембранного белка в микропрепаративном количестве для реконструкции
искусственных мембран. При выборе [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланина,
[3, 5-2H2]тирозина и [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана
в качестве источников дейтерия учитывалась их исключительная важность в
гидрофобном взаимодействии молекулы БР с лилипидным бислоем клеточной мембраны,
устойчивость к реакциям (1H-2H) обмена в водной среде в
условиях выращивания штамма-продуцента, а также возможность применения метода
высокочувствительной масс-спектрометрии электронного удара для последующего
анализа. В оптимальных условиях выращивания штамма H halobium
(синтетическая среда с 4.3 М NaCl, период инкубации 3-4 сут, 35-370С
при освещении монохромным светом с 560 нм) в клетке синтезировался
каротиноидсодержащий фиолетовый пигмент, по спектральному соотношению белкового
и хромофорного фрагментов молекулы D280/D568 1.5:1
идентичный нативному БР. Как показали результаты исследования, рост штамма на
синтетической среде (рис. 1, б) ингибировался незначительно по сравнению
с контролем (а) на протонированной среде, что существенно упрощает
оптимизацию условий биосинтеза 2Н-меченого БР, заключающуюся в
эквивалентной замене протонированных ароматических аминокислот среды их
дейтерированными аналогами - [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланином (0.26 г/л), [3,
5-2H2]тирозином (0.2 г/л) и [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофаном
(0.5 г/л).
ОБСУЖДЕНИ Е
РЕЗУЛЬТАТОВ
Основными этапами
исследования являлись: выращивание штамма экстремальных галофильных бактерий H.
halobium на синтетической среде с [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланином
(0.26 г/л), [3, 5-2H2]тирозином (0.2 г/л) и [2, 4, 5, 6,
7-2H5]триптофаном (0.5 г/л), выделение фракции пурпурных
мембран (ПМ), отделение от низко- и высокомолекулярных примесей, клеточной РНК,
каротиноидов и липидов, фракционирование солюбилизированного в 0.5% ДДС-Na
белка метанолом, гель-проникающая хроматография на сефадексе G-200,
электрофорез в 12.5% ПААГ с 0.1% ДДС-Na (рис.2). Поскольку белок локализуется в
ПМ, освобождение от низкомолекулярных примесей и внутриклеточного содержимого
достигали осмотическим шоком клеток дистиллированной водой на холоду после
удаления 4.3 М NaCl и последующим разрушением клеточной оболочки ультразвуком
при 22 кГц. Последующую обработку клеточного гомогената РНК-азой I (2-3 ед. акт.) проводили для
разрушения клеточной РНК. Поскольку фракция ПМ наряду с искомым белком в
комплексе с липидами и полисахаридами содержала примесь связанных каротиноидов
и посторонних белков, применялись специальные методы фракционирования белка без
повреждения его нативной структуры и диссоциации, что существенно усложняло
задачу выделения индивидуального БР с применением методов декаротинизации и
делипидизации, а также очистки и колоночной хроматографии. Декаротинизация,
заключающаяся в многократной обработке ПМ 50% этанолом при -50С,
являлась рутинным, но обязательным этапом, несмотря на значительные потери
хромопротеина. Использовалось не менее пяти обработок 50% этанолом, чтобы
получить спектр поглощения суспензии очищенных от каротиноидов (4) и (5) ПМ
(степень хроматографической чистоты 80-85%), показанного на рис. 3 на различных
стадиях обработки (б) и (в) относительно нативного БР (а).
Образование ретинальпротеинового комплекса в молекуле БР приводит к
батохромному сдвигу в спектре поглощения ПМ (рис. 3, в) - основная полоса (1) при максимуме
поглощения l 568 нм,
вызванная световой изомеризацией хромофора по С13=С14-кратной связи
определяется наличием транс-ретинального остатка ретиналя БР568,
дополнительная малоинтенсивная полоса (2) при l 412 нм характеризует незначительную примесь
образующейся на свету спектральной формы M412 c депротонированной
альдиминной связью между остатком транс-ретиналя и белком, а полоса (3)
при l 280 нм определяется поглощением
ароматических аминокислот в полипептидной цепи белка (для чистого БR
соотношение D280/D568 равно 1.5:1).
Фракционирование и
тщательная хроматографическая очистка белка являлись следующим необходимым
этапом. Поскольку БР, будучи трансмембранным белком (Мr 26.7
кД), пронизывает билипидный слой в виде семи a-спиралей, применение сульфата аммония и других
традиционных высаливающих агентов не дает положительного результата. Решение
проблемы заключалось в переводе белка в растворимую форму солюбилизацией в 0.5%
ДДС-Na. Использование ионного детергента ДДС-Na диктовалось необходимостью
максимальной солюбилизации белка с комбинированием стадии делипидизации и
осаждения в нативном виде, поскольку солюбилизированный в
слабоконцентрированном растворе ДДС-Na (0.5%) БР, сохраняет спиральную a-конфигурацию [9]. Поэтому отпала
необходимость использования органических растворителей ацетона, метанола и
хлороформа для очистки от липидов, а делипидизация и осаждение белка
совмещались в одну единственную стадию, существенно упрощающую фракционирование.
Значительным преимуществом метода является, что целевой белок в комплексе с
молекулами липидов и детергента распределяется в надосадочной жидкости, а
другие высокомолекулярные примеси - в непрореагировавшем осадке, легко отделяемом
центрифугированием. Фракционирование солюбилизованного в 0.5% ДДС-Na белка с
его последующим выделением в кристаллическом виде достигали в три стадии
дробным низкотемпературным (-50С) осаждением метанолом, уменьшая
концентрацию детергента соответственно в 2.5 и 5 раза. Окончательная стадия
очистки БР заключалась в отделении белка от низкомолекулярных примесей методом
гель-проникающей хроматографии, для чего БР-содержащие фракции дважды
пропускали через колонку с декстрановым сефадексом G-200, уравновешенную 0.09 М
Трис-боратным буфером (рН 8.35) с 0.1% ДДС-Na и 2.5 мМ ЭТДА (рис.3). Согласно
разработанному методу фракционирования получено 8-10 мг 2Н-меченого
БР из 1 г бактериальной биомассы, гомогенность которого удовлетворяла
требованиям, предъявляемым для реконструкции мембран и подтверждалась
электрофорезом в 12.5% ПААГ с 0.1% ДДС-Na, регенерацией апомембран с транс-ретиналем
и обращенно-фазовой ВЭЖХ метиловых эфиров N-Днс-аминокислот. Небольшой выход БР
не был препятствием для последующего масс-спектрометрического анализа, однако
здесь необходимо подчеркнуть, что для обеспечения высокого выхода белка
необходимо наработать большее количество сырьевой биомассы.
Условия проведения
гидролиза 2Н-меченого БР определялись необходимостью предотвращения
реакций изотопного (1Н-2Н) обмена водорода на дейтерий в
молекуле фенилаланина и сохранения остатков триптофана в белке. Рассматривались
два альтернативных варианта - кислотный и щелочной гидролиз. Кислотный гидролиз белка в стандартных
условиях (6 н. HСl или 8 н. H2SO4, 1100С, 24
ч), как известно, приводит к полному разрушению триптофана и частичному
разрушению серина, треонина и некоторых других аминокислот в белке [10],
которые для настоящего исследования не играют существенной роли. Модификация
этого метода, заключающаяся в добавлении в реакционную среду фенола [11],
тиогликолевой кислоты [12], b-меркаптоэтанола [13], позволяет сохранить до 80-85% триптофана.
Использование п-толуолсульфокислоты с 0.2% 3-(2-аминоэтил)-индолом или 3 М
меркаптоэтансульфокислоты [14] также эффективно для сохранения триптофана (до
93%) [15]. Однако для решения поставленной задачи вышеперечисленные методы
непригодны, поскольку обладают существенным недостатком: в условиях кислотного
гидролиза с высокой скоростью происходит изотопный обмен ароматических протонов
(дейтеронов) в молекулах триптофана, тирозина и гистидина [16], а также
протонов при атоме С3 аспарагиновой и С4 глутаминовой кислот [17]. Поэтому даже
проведение гидролиза в дейтерированных реагентах (6 н. 2HCl, 4 н. 2H2SO4
в 2H2O) не позволяет получать реальные данные о включении
дейтерия в белок.
В условиях щелочного
гидролиза (4 н. Ba(OH)2 или 4 н. NaOH, 1100C, 24 ч)
реакций изотопного обмена водорода практически не наблюдается (исключением
является протон (дейтерон) у атома С2 гистидина, а триптофан не разрушается,
что определило выбор метода гидролиза в настоящей работе. Упрощение процедуры
выделения смеси свободных аминокислот за счет нейтрализации серной кислотой
явилось причиной выбора в качестве гидролизующего агента 4 н. Ba(OH)2.
Возможная D,L-рацемизация аминокислот при щелочном гидролизе не
влияла на результат последующего масс-спектрометрического исследования уровня
дейтерированности молекул аминокислот.
Уровень дейтерированности, % от
общего количества атомов водорода
N- Dns-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]Phe-Ome
413
414
415
416
417
418
7
18
15
11
14
6
1
2
3
4
5
6
13
25
38
50
63
75
N-Dns-[3, 5-2H2]Tyr-OMe
428
429
430
12
15
5
-
1
2
-
14
29
N-Dns-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]Trp-OMe
453
454
455
456
457
5
6
9
11
5
2
3
4
5
6
26
38
50
64
77
Для изучения уровня
дейтерированности 2H-меченого БР использовали метод
масс-спектрометрии электронного удара (чувствительность 10-8-10-10
моль анализируемого вещества [18]) после модификации смеси свободных
аминокислот гидролизата БР в метиловые эфиры N-Днс-производных аминокислот.
Чтобы получить воспроизводимый результат по уровню дейтерированности 2Н-меченого
белка, сначала регистрировали полный скан масс-спектр электронного удара смеси
метиловых эфиров N-Днс-производных 2Н-меченых аминокислот, по пикам
молекулярных ионов которых (М)+ рассчитывали уровень
дейтерированности молекулы. Затем проводили разделение метиловых эфиров
N-Днс-производных ароматических аминокислот обращенно-фазовой ВЭЖХ и получали
масс-спектры электронного удара для каждой индивидуальной аминокислоты. Полный
масс-спектр электронного удара смеси метиловых эфиров N-Днс-производных
аминокислот, показанный на рис. 4 (сканирование при m/z 50-640, базовый
пик m/z 527, 100%), отличался непрерывностью, пики в интервале m/z
от 50 до 400 на шкале массовых чисел представлены фрагментами метастабильных
ионов, низкомолекулярных примесей, а также продуктами химической модификации
аминокислот. Анализируемые 2Н-меченые ароматические аминокислоты,
занимающие шкалу массовых чисел m/z от 415 до 456 представлены смесями
молекул с различным количеством включенных атомов дейтерия, поэтому
молекулярные ионы (М)+ полиморфно расщеплялись на отдельные кластеры
со статистическим набором значений m/z зависимости от количества
водородных атомов в молекуле. Учитывая эффект изотопного полиморфизма, подсчет
уровня дейтерированности молекул аминокислот проводили по наиболее
распространенному пику молекулярного иона (М)+ в каждом кластере с
математически усредненной величиной (М)+ (рис. 4) - для фенилаланина пик молекулярного
иона определялся (М)+ при m/z 417, 14% (вместо (М)+ при
m/z 412, 20% для немеченого производного (пики немеченых аминокислот не
показаны)), тирозина -
(М)+ при m/z 429, 15% (вместо (М)+ при m/z
428, 13%), триптофана -
(М)+ при m/z 456, 11% (вместо (М)+ при m/z
451, 17%). Уровень дейтерированности, соответствующий увеличению молекулярной
массы составил для тирозина два, фенилаланина и триптофана - пять атомов дейтерия. Полученные
данные по уровню дейтерированности фенилаланина, тирозина и триптофана
позволяют сделать вывод о высокой селективности включения 2H-меченых
ароматических аминокислот в молекулу БР: дейтерий детектировался во всех
остатках ароматических аминокислот (таблица). Обсуждая полученные результаты,
необходимо подчеркнуть, что присутствие в масс-спектре пиков (M)+ протонированных
и полудейтерированных аналогов фенилаланина с (M)+ при m/z
413-418, тирозина с (M)+ при m/z 428-430 и триптофана с (M)+
453-457 с различными вкладами в уровни дейтерированности молекул,
свидетельстствует о сохранении небольшой доли минорных путей биосинтеза de
novo, приводящим к разбавлению дейтериевой метки и, по-видимому,
определяется самими условиями биосинтеза 2Н-меченного БР (таблица).