Дипломная работа: Параметры функционирования митоКАТФ у животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию
Дипломная работа: Параметры функционирования митоКАТФ у животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию
Содержание
Список сокращение
Введение
Глава
1. Обзор литературы
1.1
Системы транспорта калия в митохондриях
1.1.1 Транспорт калия в митохондрии
1.1.2
Молекулярные
структуры, ответственные за транспорт калия в МХ
1.1.3 Физиологическое значение транспорта калия
в МХ
1.1.4 АТФ-ингибируемые калий-транспортирующие каналы
1.2 АТФ-зависимый калиевый канал
цитоплазматической мембраны
1.2.1 Структурная организация цитоплазматического
АТФ-зависимого калиевого канала
1.3 АТФ-чувствительный калиевый канал
внутренней мембраны МХ
1.3.1 Структурная организация митоКАТФ канала
Глава 2. Модуляторы
2.1 Модуляторы митоКАТФ канала
2.1.1 Метаболические модуляторы митоКАТФ канала
2.2 Функциональная роль митоКАТФ
2.2.1 Активация
митоКАТФ в развитии устойчивости организма к гипоксии
2.2.2 Механизмы защиты сердца при гипоксии,
опосредованные активацией митоКАТФ
2.2.3 Феномен прерывистой гипобарической тренировки
2.3 Выделение МХ
2.3.1 Выделение МХ
печени крысы
2.3.2 Выделение МХ сердца крысы
2.3.2 Выделение и очистка митоКАТФ
канала
Глава 3. Изучение энергозависимого
входа К+ в МХ методом спектрофотометрии
3.1
Изучение ДНФ-индуцированного выхода ионов калия из МХ
3.2 Получение и очистка антител к белку с
молекулярной массой 55 кДа.
3.2.1
Подготовка белка с
м.м. 55 кДа: выделение и очистка
3.3
Иммунизация
и анализ препарата антител
3.3.1
Детекция
специфических антител и определение титра
3.3.2
Вестерн-Блот анализ
3.4 Исследование ДНФ-индуцированного выхода
К+ из митохондрий с помощью К+-селективного электрода
3.5 Реконструкция белка в БЛМ
3.6 Иммунноэлектронная
микроскопия
3.7
MS-MALDI-TOF/TOF- анализ
3.8
Очистка
антител к АТФ-зависимому белку с м.м. 55 кДа
3.9
Очистка
антител к АТФ-зависимому белку с м.м. 55 кДа на колонке с иммобилизованным
Белком А
3.10 Ингибиторный
анализ с использованием антител к белку
с м.м. 55 кДа
Глава 4. Выделение
комплекса цитоплазматических мембран и микросом печени крыс
4.1 Метод отбора высоко- и низкоустойчивых
животных
Глава
5. Результаты и обсуждения
5.1 Параметры функционирования
митоКАТФ канала у крыс с различной резистентностью, а также у животных,
адаптированных к гипоксии
5.1.1 Изучение параметров дыхания и
окислительного фосфорилирования в МХ печени и сердца крыс с различной
резистентностью к гипоксии
5.1.2 Изучение
параметров АТФ-зависимого транспорта К+ в МХ печени сердца крыс с различной
резистентностью к гипоксии
5.1.2 Изучение
параметров АТФ-зависимого транспорта К+ в МХ печени сердца крыс с различной
резистентностью к гипоксии
5.2 Изучение структурной организации
митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала
5.2.1 Определение гомологии белка с м.м. 55 кДа
методом MS-MALDI-TOF/TOF
5.3 Ингибиторный анализ активности митоКАТФ
канала с использованием антител, полученных на белок с м.м. 55 кДа
5.3.1 Определение степени чистоты белка,
используемого для иммунизации
5.4 Иммунизация и определение титра полученных
антител
5.4.1 Определение специфичности полученных
антител
5.4.2 Выделение иммуноглобулинов G (IgG) из
антисыворотки и проведение ингибиторного анализа
5.5 Электронная микроскопия МитоКАТФ
канала
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
МитоКАТФ –
митохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал
ЦитоКАТФ –
цитоплазматический АТФ-чувствительный калиевый канал
5-ГД –
5-гидроксидекановая кислота
Глиб – глибенкламид
АТФ –
аденозин-5’-трифосфат
УТФ – уридин-5’-трифосфат
УДФ – уридин-5’-дифосфат
УМФ –
уридин-5’-монофосфат
ГТФ – гуанин-5’-трифосфат
МХ – митохондрии
АТ – антитела
ФН –
неорганический фосфат
АФК – активные формы
кислорода
KIR – inward rectifying K+
channels (канальная субъединица митоКАТФ канала)
SUR – sulphonyl urea
receptor (регуляторная субъединица митоКАТФ канала,
чувствительная к
сульфонилмочевинам)
PCO’s – potassium channel
openers (активаторы калиевых каналов)
NFBs –
nucleotide phosphate binding domains (нуклеотидсвязывающие участки)
БЛМ – бислойные липидные
мембраны
ФИА - феномен ишемической
адаптации
ГТ – гипоксическая
тренировка
НУ – крысы,
низкоустойчивые к гипоксии
ВУ – крысы, высокоусточивые
к гипоксии
Введение
Митохондриальный
АТФ-ингибируемый калиевый канал (митоКАТФ), осуществляющий вход
калия в МХ, был обнаружен методом пэтч-кламп во внутренней мембране МХ в 1991 г. [Inoue et al., 1991]. Однако, еще в 1981 г. в лаборатории проф. Мироновой был выделен белок с
м.м. 55 кДа, обладающий свойствами данного канала. [Миронова и др., 1981].
Позднее было показано, что выделенный белок-канал ингибируется физиологическими
концентрациями АТФ [Paucek et al., 1992; Миронова и др., 1996 (I)].
В настоящее
время достаточно хорошо исследованы биофизические свойства митохондриального
калиевого канала и его физиологическая роль [Миронова и др., 1996 (I, II);
Paucek et al., 1992; Inoue et al., 1991; Garlid et al., 1997; Mironova et al.,
1999; 2004]. Интерес к исследованию этого канала в последнее время возрос,
поскольку было показано, что он, а именно его активация, играет ключевую роль в
защите миокарда при ишемии [Grover et al., 1992; Garlid et al., 1997; Vanden
Hoek, 2000]. Найден целый ряд синтетических активаторов митоКАТФ,
являющихся потенциальными кардиопротекторами [Gross et al., 1992; Liu et al.,
1998; Sato et al., 1998; Tsai et al., 2002]. Недавно в лаборатории проф.
Мироновой был обнаружен эффективный природный метаболический активатор митоКАТФ
– уридин-5’-дифосфат (УДФ) [Mironova et al., 2004; Негода А.Е., 2004].
Метаболические активаторы канала имеют ряд преимуществ, по сравнению с их
синтетическими аналогами, поскольку их концентрацию в клетке можно регулировать
и они не обладают отрицательными побочными эффектами. Действие УДФ, как
активатора К+-канала, и, следовательно, кардиопротектора, до
настоящего времени не было изучено на животных.
Помимо важной
роли митоКАТФ в защите миокарда от ишемических повреждений,
некоторые исследователи предполагают участие активации канала в формировании
устойчивости организма к кислородному голоданию [Zhu et al., 2003]. Однако
прямые доказательства участия канала в адаптации к гипоксии до настоящего
времени не получены, то есть, данный феномен также требует дополнительных
исследований.
К настоящему
времени нами разработана рабочая модель структуры и регуляции канала, в
соответствии с которой митоКАТФ канал состоит из двух субъединиц –
канальной (с молекулярной массой 55 кДа) и регуляторной (с молекулярной массой
63 кДа). Однако вопрос о структуре канала и возможной гомологии с другими
белками пока остается открытым. Изучение структуры митоКАТФ позволит
исследовать функцию и регуляцию канала на молекулярном уровне.
В связи с
этим, целью данной работы было: изучить структурную
организацию митоКАТФ канала, кардиопротекторное действие УДФ при
ишемии миокарда, исследовать параметры функционирования митоКАТФ у
животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к
кислородному голоданию.
Таким образом, в работе были поставлены следующие задачи:
1)
Исследовать
параметры функционирования митоКАТФ у крыс с различной устойчивостью
к гипоксии, а также у животных, адаптированных к недостатку кислорода.
2)
Определить
гомологию структуры исследуемого белка с м.м. 55 кДа аминокислотным
последовательностям известных белков.
3)
Получить
специфические поликлональные антитела на белок-канал с м.м. 55 кДа, формирующий
при встраивании в искусственные мембраны АТФ-ингибируемые К+ каналы.
4)
Провести
ингибиторный анализ АТФ-чувствительного транспорта калия в нативных МХ с
использованием полученных антител (АТ) с целью доказательства принадлежности
белка с м.м. 55 кДа к системе АТФ-зависимого транспорта К+ в МХ.
5)
Исследовать
иммунолокализацию МитоКАТФ канала на срезе гепатоцитов и
кардиомиоцитах при помощи электронной микроскопии
Глава 1. Обзор литературы
1.2
Системы транспорта калия в митохондриях
1.1.1 Транспорт
калия в митохондрии
Транспорт К+
в митохондриях (МХ) имеет большое функциональное значение, так как концентрация
К+ в цитоплазме значительно превышает концентрацию других катионов,
и появление любой неконтролируемой проницаемости митохондриальной мембраны для
К+ может представлять угрозу осмотической целостности и
функциональной интегральности МХ [Brierley et al., 1983]. МХ занимают 40%
внутриклеточного пространства в сердечной клетке и до 20% - в клетке печени и
по данным [Rottenberg, 1973], в свободном состоянии в матриксе МХ содержится 95
нмоль К+/мг белка МХ, в слабосвязанном состоянии – 45 нмоль и в
прочносвязанном – 5 нмоль. Концентрация свободного калия в цитоплазме
составляет 90-120 нмоль.
Хемиосмотическая
теория Митчела включает четыре постулата, последние два из которых имеют
отношение к системе транспорта катионов. Согласно этим двум постулатам,
внутренняя мембрана МХ: а) непроницаема для Н+, ОН- и
всех прочих ионов; б) содержит ряд белков-переносчиков, осуществляющих
транспорт неорганических ионов и необходимых метаболитов. Таким образом, по
Митчелу, внутренняя мембрана МХ непроницаема для катионов и анионов. Однако
из-за большого электрохимического потенциала [Δφ] (~ –200 мВ с
матриксной стороны) одновалентные катионы (К+ и Na+)
могут диффундировать через липидный бислой. Проблема такой утечки будет
наиболее актуальна для ионов К+, как основного катиона цитозоля и
матрикса, хотя скорость такой диффузии будет не велика.
Что касается
специфических систем транспорта, то было установлено, что в МХ существуют
системы: 1) электрогенного входа калия и 2) К+/Н+-антипортер
[Chavez et al., 1977; Diwan, 1981; Garlid, 1980], о существовании которого
говорил Митчел [Mitchell and Moyle, 1969].
В работах с
использованием радиоактивного калия (42К+) было показано,
что активный транспорт К+ в МХ осуществляется электрогенно и что
существует специфическая К+-транспортирующая система,
функционирующая подобно ионофорам, катализирующим унипорт калия [Gamble, 1957,
1962; Judan et al., 1965; Rottenberg, 1973; Chavez et al., 1977].
В качестве
системы электрогенного транспорта К+ в МХ предлагались следующие
варианты: 1) подвижный переносчик или канал [Jonston and Griddle, 1978; Panov
et al., 1980; Jung et al., 1982]; 2) электродиффузное движение через
гидрофильные поры и 3) вход калия с участием белковых транспортных систем,
которые помимо своей основной функции, могут осуществлять транспорт К+
[Brierly, 1980, 1983].
1.1.3 Молекулярные структуры, ответственные за транспорт калия в МХ
В настоящее время в литературе в качестве
транспортных систем, осуществляющих электрогенный транспорт калия в МХ,
рассматриваются следующие структуры: 1) АТФ/АДФ-антипортер или
аденинуклеотидтранслоказа (АНТ) [Panov et al., 1980; Le Quoc et al., 1988] и 2)
специфические белки, которые образуют во внутренней мембране МХ канал для
электрогенного входа ионов калия [Миронова и др., 1981; Diwan et al., 1988; Paucek et a., 1992]. В первом случае
предполагается, что АНТ, помимо основных функций, может работать как система
электрофоретического транспорта ионов калия в МХ при действии на МХ
субмикромолярных концентраций ионов кальция, и как неспецифическая пора для
низкомолекулярных соединений при повреждении МХ высокими концентрациями Ca2+ [Jung and Brierley, 1981; 1982; Halestrap et al., 1986].
Что касается специфических белков, следует
отметить, что в лаборатории Мироновой в 1981 г. методом водно-этанольной экстракции из МХ сердца быка был выделен и очищен белок с м.м. 55 кДа, который при
реконструкции в бислойные липидные мембраны (БЛМ) образовывал К+-селективные
каналы проводимости [Миронова и др., 1981], которые, как было показано позднее,
ингибируются физиологической концентрацией АТФ и глибенкламидом, и относятся к
семейству АТФ-чувствительных калиевых каналов [Миронова и др., 1996 (I); Mironova et al., 1999]. Структура
митохондриального КАТФ канала не определена [Paucek et al., 1992].
Диван с соавторами, используя детергент Тритон
Х-100, из МХ мембраны печени крыс выделили белок с м.м. 53 кДа [Diwan et al., 1988]. Реконструировав
его в липосомы, авторы показали, что этот белок также обладает свойствами,
характерными для К+ унипортера.
Известно, что в МХ помимо системы электрогеннного
входа К+ существует система электронейтрального выхода К+
в обмен на Н+ [Garlid and Paucek, 2003]. При этом внешняя
МХ мембрана не препятствует дальнейшему обмену небольшими ионами с цитоплазмой.
Система электрогенного входа калия и
электронейтрального К+/Н+-обменника образуют К+
цикл МХ (Рис.1).
Рис. 1. МХ калиевый цикл по Garlid and Paucek,
2003. ЭТЦ
– электрон-транспортная цепь; ММП – межмембранное пространство; Фн –
неорганический фосфат.
Электрогенный выброс протонов
электрон-транспортной системой генерирует мембранный потенциал, который, в свою
очередь, стимулирует диффузию К+ в матрикс МХ («утечка калия» или К+
leak) и вход иона,
опосредованный неким специфическим калиевым каналом. Такой обмен Н+
на К+ подщелачивает матрикс, вызывая вход фосфата по
электронейтральному Фн-Н+ симпортеру (Фн – неорганический фосфат)
(Рис.1).
Вход К+ сопровождается накоплением
осмотически облигатной воды, что проявляется в набухании МХ. Излишнее их
набухание может угрожать целостности этих органелл, следовательно, избыток К+
необходимо удалять. Эту функцию выполняет белок с м.м. 82 кДа - К+/Н+-антипортер
[Brierley G., 1976; Garlid K., et al., 1980; 1988]. Следует
отметить, что вход К+ путем диффузии слишком мал, чтобы существенно
влиять на изменение объема матрикса МХ. Интенсивный вход калия в МХ
обеспечивается специфическими белками, осуществляющими электрофоретический вход
К+ в МХ [Mironova G., 1981; Diwan J., et al., 1988; Paucek et al., 1992].
Предполагается, что основное физиологическое
значение систем транспорта К+ в МХ связано с регуляцией объема МХ
матрикса. Объем МХ определяется калиевыми токами через внутреннюю мембрану.
Когда вход и выход К+ находятся в равновесии, калиевые потоки
определяются электронейтральным током анионов и осмотически облигатной воды [Garlid, 1988]. Так как
концентрация ионов калия в матриксе и в цитоплазме практически одинаковая,
транспорт калия мало влияет на матриксную концентрацию калия, но может иметь большое
влияние на объем МХ. Небольшое нескомпенсированное увеличение входа К+
в МХ может удваивать их объем в течение 1-2 минут [Garlid, 1979]. В свою очередь,
увеличение матриксного объема стимулирует активность дыхательной цепи, что было
показано на МХ сердца и печени [Nichols and Lindberg, 1972; Halestrap, 1989]. Окисление жирных
кислот также чувствительно к изменению объема матрикса [Halestrap, 1987].
Увеличение в МХ концентрации К+ и
последующее изменение их объема имеет значение и в регуляции митохондриальных
процессов у зимоспящих животных [Fedotcheva et al., 1985; Бакеева и
Брустовецкий, 1993], а также при адаптации животных к холоду [Nedergraard and Cannon, 1987]. В ряде работ
установлено, что in vivo, гормон, участвующий в регуляции теплопродукции (тироксин),
активирует системы электрогенного транспорта К+, вызывая
низкоамплитудное набухание МХ [Halestrap, 1987; Shears an Brouk, 1980]. В нашей
лаборатории, было показано, что активность системы электрогенного транспорта
ионов калия прямо коррелирует с интенсивностью термогенеза [Федотчева и др.,
1984; Миронова и др., 1986], что непосредственно связано с увеличением
содержания ионов калия в МХ бурой жировой ткани и печени [Скарга, 1994].
Активацию транспорта калия при выходе животного из спячки, связывают с
активацией футильного цикла К+ в МХ, приводящей к увеличению
теплопродукции, до начала синтеза АТФ в МХ [Миронова и др., 1986].
Обнаружено также, что митоКАТФ канал
играет существенную роль в нормальной физиологии миокарда, регулируя объем
митохондрий и продукцию активных форм кислорода (АФК) [Garlid et al., 2003a].
В последнее время интерес ученых к митоКАТФ
каналу вызван обнаружением его роли в защите сердца от инфаркта. Исследования
были стимулированы открытием феномена кардиопротекторного действия прерывистой
гипоксии, приводящей к активации митоКАТФ [Murry et al., 1986]. Установлено,
что фармакологические активаторы митоКАТФ канала предохраняют сердце
от ишемических повреждений [Garlid et al., 1997].
1.1.4 АТФ-ингибируемые калий-транспортирующие каналы
К+ каналы, активность которых
ингибируется физиологическими концентрациями АТФ впервые были обнаружены в
цитоплазматической мембране кардиомиоцитов [Noma, 1983]. С тех пор,
аналогичные каналы были найдены в β клетках поджелудочной железы [Dunne and Petersen, 1991], в скелетной
мускулатуре [Spruce et al., 1985; Woll et al., 1989], в нервных
клетках [Jonas et al., 1990] и гладких мышцах [Standen et al., 1989]. Активность
АТФ-чувствительных калиевых каналов (КАТФ каналов) связана с уровнем
биоэнергетического метаболизма клетки (концентрацией АТФ) и электрическими
свойствами возбудимости плазматической мембраны. Микромолярные концентрации АТФ
и сульфонилмочевины – класс гипогликемических соединений, использующихся при
лечении диабета, регулируют активность всех представителей семейства КАТФ
каналов [Ashcroft et al., 1989]. Концентрация кальция и изменение
мембранного потенциала практически не влияют на активность этих каналов [Ashcroft and Ashcroft, 1990]. В то же время, в
кортикальных и гипоталамических нейронах КАТФ каналы [Ashford et al., 1989; Ashford et al., 1988] менее
чувствительны к АТФ (для их ингибирования нужны миллимолярные концентрации). В
эпителиальных клетках (назальные полипы) также были обнаружены КАТФ
каналы с низкой чувствительностью к АТФ, но активирующиеся микромолярными
концентрациями Ca2+ [Kunzelmann et al., 1989]. При этом, все вышеперечисленные каналы
высокоселективны для ионов К+.
В МХ мембране также были обнаружены АТФ-зависимые
К+ каналы. Так, в 1991 г. впервые с использованием метода петч-кламп
[Inoue et al., 1991] на митопластах
было показано, что во внутренней мембране МХ присутствуют высокоселективные по
К+ каналы с невысокой проводимостью. Обнаружено, что каналы могут
обратимо ингибироваться АТФ, а так же 4-аминопиридином и специфическим
ингибитором цитоплазматического КАТФ канала – глибенкламидом с
матриксной стороны [Inoue et al., 1991]. Однако, как было сказано выше, еще в
1981 году в лаборатории проф. Мироновой во внутренней мембране МХ был обнаружен
К+-селективный АТФ-ингибируемый канал [Миронова и др., 1981; 1996;
1997; 1999], принадлежащий к семейству КАТФ каналов [Paucek et al., 1992]. Данный канал
имеет те же характеристики проводимости, что и канал, обнаруженный методом
пэтч-кламп. В настоящее время он интенсивно изучается, поскольку играет важную
роль в функционировании клетки. Однако вопрос о его структуре требует
дальнейших исследований.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
|