Дипломная работа: Методы диагностики и профилактики микробной контаминации при трансплантации эмбрионов

Дипломная работа: Методы диагностики и профилактики микробной контаминации при трансплантации эмбрионов

Содержание

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Состояние и перспективы применения метода трансплантации эмбрионов

1.2 Чувствительность матки к инфекциям в разные периоды полового цикла

1.3 Предупреждение заноса инфекции в матку при извлечении и пересадке эмбрионов

1.4 Влияние микроорганизмов на спермии, яйцеклетки и эмбрионы

1.5 Влияние антибиотиков на спермии, яйцеклетки, эмбрионы

2. Собственные исследования

2.1 Цель и задачи

2.2 Материалы и методика исследований

2.2.1 Подготовка лаборатории, посуды и инструментов для манипулирования с эмбрионами

2.2.2 Подготовка доноров и реципиентов

2.2.3 Извлечение и подготовка эмбрионов к пересадке

2.2.4 Влияние микробного фактора на приживляемость эмбрионов

2.3 Анализ экономической деятельности предприятия

2.4 Характеристика предприятия

2.5 Результаты исследований

2.5.1 Разработка мер предупреждения микробной контаминации эмбрионов на технологических этапах их подготовки

2.5.2 Экономическая эффективность ветеринарных мероприятий

2.6 Обсуждение результатов собственных исследований

3. Охрана труда

3.1 Организация охраны труда

3.2 Производственная санитария

3.3 Пожарная безопасность

Выводы и предложения

Выводы

Предложения производству

Список литературы

Введение

Современные темпы развития животноводства требуют совершенствования существующих методов селекционной работы с целью создания и ускоренного размножения высокопродуктивных животных (А.П. Студенцов и др. 2000). Более интенсивное использование репродуктивного потенциала ценных в племенном отношении женских особей возможно при трансплантации эмбрионов.

Одним из главных условий успешного применения метода трансплантации эмбрионов в животноводстве является асептичность проводимых операций (A. Brand et al., 1978; H. Kupferschmid; 1984 E. Singh, 1985; А. Овчинников, 1985; Ф.И. Осташко и соавт., 1986).

В технологии трансплантации эмбрионов важное место отводится разработке методов, предупреждающих возможность контаминации их патогенной микрофлорой, которые обеспечивают получение здоровых телят и профилактируют появление гинекологических болезней, в частности, эндометритов как у коров – доноров, так и у реципиентов.

При манипулировании с эмбрионами вне организма нельзя допускать их инфицирования и переноса микроорганизмов в матку реципиента (M. Tibier, 1985; I. Atwell, 1987). Бактериальному загрязнению эмбрионы подвергнуты и при их оценке. Многие авторы утверждают, что как яйцеклетка, так и эмбрион с интактной зоной пеллюцида надежно защищены от микробного фактора, тем не менее, некоторые из них рекомендуют многократное отмывание эмбрионов в стерильных буферных средах или в средах с добавлением ферментов (R.A. Bowen et al., 1983; E. Singh et al., 1982; 1983; W. Hare et al., 1984). Именно поэтому руководством международного общества по пересадке эмбрионов (Manual of the international embryo transfer, 1986) предусмотрен санитарный контроль их качества.

В нашей стране и за рубежом ведутся интенсивные работы по разработке оптимальных способов трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. Продолжаются исследования по совершенствованию гигиенических и технических приемов получения и пересадки эмбрионов.

Анализ литературных данных показал целесообразность исследований по совершенствованию гигиенических приемов при трансплантации эмбрионов. Это продиктовано недостаточным количеством      противоречивых данных о влиянии микроорганизмов на приживлямость эмбрионов. Существует мнение, что внесение инфекции в матку с пистолетом Кассу не является причиной яловости, если в остальном соблюдена асептика (A. Brand, 1976; A. Trounson, 1978). Однако, в качестве дополнительной предосторожности от возможности внесения влагалищной инфекции в матку реципиента кембриджские сотрудники покрывали наконечник пистолета пластиковым чехлом. Другие исследования А. Бранда показали, что даже в случае отрицательной бактериологической пробы инструмента после нехирургической трансплантации эмбрионов может произойти вирусное заражение в ходе ее осуществления (A. Brand, 1978). Оно может быть причиной последующих осложнений, в частности, эндометритов. А у коров-доноров, больных эндометритом, наблюдали частичную или полную дегенерацию эмбрионов на разных стадиях их развития, при значительном числе неоплодотворенных яйцеклеток (А.Д. Бугров и соавт., 1988). Поэтому стало необходимым более детально изучить вопросы бактериальной контаминации половых путей коров и телок при манипуляциях извлечения и пересадки эмбрионов, влияние ее на их приживляемость, с одной стороны, и найти эффективные антимикробные средства, с другой стороны.

Целью нашей работы была разработка методов профилактики и санитарного контроля технологических процессов при трансплантации эмбрионов у крупного рогатого скота.

Для достижения этой цели нами поставлены на разрешение следующие задачи:

1. Изучить бактериальную контаминацию половых путей телок-реципиентов в фолликулярную и лютеальную фазы полового цикла.

2. Изучить влияние антибактериальных препаратов на микрофлору половых путей после их санации непосредственно перед извлечением и пересадкой эмбрионов.

3. Провести сравнительную оценку антибактериальных препаратов для санации половых путей.

4. Испытать антибиотики для санации промывных буферных сред и отмывки эмбрионов.

5. Изучить влияние испытанных нами антибактериальных препаратов на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов.

1. Обзор литературы

1.1 Состояние и перспективы применения метода трансплантации эмбрионов

Трансплантация эмбрионов женским особям сравнима по возможностям с техникой искусственного осеменения, позволяющей полнее использовать генотип выдающихся самцов. Однако широкое внедрение этой перспективной технологии сдерживается несовершенством методов получения большого числа зрелых, полноценных, способных к оплодотворению ооцитов (Y. Koinig., 1980), а также сравнительно высокой трудоемкостью и стоимостью работ (В.В. Мадисон, В.Л. Мадисон, 1988).

В странах СНГ работы по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота начаты в 1975 г. Первые телята были получены в начале 1977 г. (М.И. Прокофьев и соавт., 1977) во Всесоюзном НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных, а первый теленок от пересадки замороженного эмбриона во Всесоюзном институте животноводства в 1980 г. С 1983 года организованы четыре центра трансплантации эмбрионов: ВИЖ, ВНИИРГЖ, НИИЖ Лесостепи и Полесья. УССР, Украинский НИИ разведения и искусственного, осеменения крупного рогатого скота (Н.З. Жильцов, В.В. Мадисон и соавт., 1986). Мировая практика пересадки эмбрионов успешно развивается. Применение метода трансплантации эмбрионов непрерывно растет. При этом технология технически совершенствуется, а эффективность метода возрастает (Ф.И. Осташко, 1995; Т.И. Шкиль, 1995; Ф.С. Мауссе, 1999; М.Л. Дибиров, 2000).

В настоящее время наиболее эффективен нехирургический метод трансплантации эмбрионов. В среднем на современном уровне биотехнологи получают с применением пересадки эмбрионов около 10 телят, а в отдельных случаях до 50 телят от одного донора в год, тогда как при обычном способе размножения (искусственном осеменении) корова за всю жизнь могла бы воспроизвести 7–8 телят. Поэтому идея получения максимального числа потомков от лучших по продуктивности самок издавна привлекала внимание исследователей. Решение этой проблемы стало возможным на основе применения метода трансплантации эмбрионов (Ю.Д. Клинский, 1978, 1980; Н.И. Сергеев, 1979,1984; М.И. Прокофьев, 1983).

В последние годы в ряде стран изучают вопрос о возможности переноса заразных болезней путем эмбриональной пересадки реципиентам от коров-доноров. Ряд зарубежных авторов считают, что методом трансплантации эмбрионов можно успешно вести борьбу со многими инфекционными болезнями. По некоторым опубликованным данным отдельные инфекции, например, инфекционный ринотрахеит, вирусная диарея, блутанг, лейкемия крупного рогатого скота реципиентам с трансплантируемым зародышем от больного донора не передаются (R.A. Bowen et al., 1983; Е. Singh et al., 1983; Z. Pokorny et al., 1983; L. Elizabeth, 1984).

По данным французских исследователей, вирус лейкоза крупного рогатого скота и вирус катаральной лихорадки при эмбриотрансплантации не передаются через эмбрионы с интактной зоной пеллюцида, если их до пересадки промыть раствором трипсина (W.C. Наге, 1984).

Несмотря на достигнутые успехи в разработке приемов вызывания множественной овуляции у коров и телок-доноров эмбрионов, технике извлечения и пересадке зародышей, выход полноценных эмбрионов и их приживляемость не стабильна.

Многие вопросы теории и практики требуют дальнейшего изучения и совершенствования.

Проблемными остаются вопросы предупреждения заноса инфекции в матку при извлечении и пересадке эмбрионов.

3.2 Чувствительность матки к инфекциям в разные периоды полового цикла

Здоровый организм млекопитающих имеет целую систему защитных приспособлений, поэтому деятельность микроорганизмов-сапрофитов ограничивается и не является болезнетворной. В норме эта микрофлора отсутствует в глубоких отделах полового тракта самки, сообщающегося с брюшной полостью (В.П. Буркат, Г.Г. Харута та ін. 1995; Н.А. Мартыненко, 1971; Е.В. Козловский, П.А. Емельяненко, 1982), хотя во влагалище, помимо постоянно заселяющих его молочнокислых палочек, находят различные виды кокков и другие бактерии. Многочисленными исследованиями установлено, что в половых путях коров с нормальной и нарушенной воспроизводительной функцией часто присутствуют штаммы условно-патогенной микрофлоры: E.coli, Klebsiella, Serritia, Proteus, Pseudomonas (Е.М. Махиня, 1958; D.S. Sambijal et al., 1986; Д.А. Сайкиа и соавт., 1987), но у большинства животных во время течки и охоты микрофлора погибает и смывы, полученные со слизистой оболочки влагалища коров, свободны от микроорганизмов (А.А. Осетров и соавт., 1966). С другой стороны, условнопатогенная микрофлора часто попадает в половые пути самок со спермой производителей, используемой при искусственном осеменении (С.Л. Семенов, 1955; О.И. Пантюхова, 1961; В.А. Яблонский, 1963; Ф.М. Касумов, 1963; Д.Д. Логвинов, 1968).

Многие ученые занимались изучением микробной загрязненности спермы производителей (Качмар О.М.; Авдосьева I.К.; Урус Р.В.), применяемой для искусственного осеменения самок, на их репродуктивную функцию. Большинство из них признают отрицательное действие микробов, попадающих в половые пути коров и телок при искусственном осеменении, на их воспроизводительную деятельность. В.К. Милованов (1964) утверждает, что причиной эмбриональной смертности является неспецифическая микрофлора, попадающая в матку со спермой. Д.Д. Логвинов (1972) считает, что прямой причиной снижения качества и оплодотворяющей способности спермы, частых абортов, массовых задержаний последа, эндометритов, бесплодия, эмбриональной смертности и понижения жизнеспособности новорожденных является обильное микробное загрязнение спермы производителей, применяемой для искусственного осеменения самок. Д. Логвинов, В. Плугатырев, В. Кошевой (1972) в 47,9% случаев выделили различные бактерии из околоплодных вод искусственно осемененных коров и в 6% случаев выделили различные бактерии из околоплодных вод естественно осемененных нетелей.

Бактериологический метод выделения кампилобактерий из спермы производителей трудоемок, длителен и неэффективен из-за частой контаминации спермы посторонней микрофлорой. Отсутствие антител в сперме животных не всегда позволяет сделать заключение о том, что сперма свободна от возбудителей кампилобактериоза (Родина В.Н., Бондаренко В.З.; Козло В.Н.; Скляров О.Д.; Советкин С.В.).

Другие авторы отмечают отсутствие отрицательного влияния естественной контаминации половых путей условно патогенной микрофлорой на воспроизводительную функцию коров и связывают это с тем, что:

1. Число микробных тел этих бактерий, попадающих вместе со спермой в матку невелико, оно колеблется от 0 до 10 млн./мл (Б.Д. Кондратов и соавт., 1976).

2. В процессе эволюции у животных сложились мощные иммунные барьеры, препятствующие инфицированию половых путей микрофлорой.

Основными факторами, обеспечивающими защиту половых путей коров и телок от условно патогенной микрофлоры, являются: а) Барьерные функции слизистых оболочек. Так, слизистая оболочка шейки матки функционирует как железа, выделяющая цервикальную слизь, содержащую муцины, обладающие биологически важными свойствами: абсорбции, бактерицидности, бактериостатичности (Н.А. Мартыненко, 1971; А.И. Варганов, 1979; В.П. Полищук, 1984; В.С. Шипилов, 1988). Р. Рафаван и соавт. установили, что во время течки отмечается сдвиг РН в кислую сторону, что в значительной степени предотвращает проникновение в полость матки через раскрытую шейку матки различных микробов (R. Raghavan et al., 1971, І.Г. Мороз та ін., 2000). Количество шеечного секрета у небеременных коров незначительное, но во время беременности обнаруживается большое скопление его в устье шейки матки в виде слизистой пробки, во время охоты слизь маловязкая, прозрачная и выделяется в большом количестве (В.С. Шипилов и соавт., 1987; 1988).

б) Активная деятельность поли- и мононуклеарных фагоцитов (И.И. Соколовская, 1973; С.Д. Ватсон, 1985).

в) Наличие системы естественных опсонинов и иммуноглобулинов (И.И. Соколовская, 1973; О.Д. Ватсон, 1985).

В период течки под воздействием эстрогенов происходит активация как специфических, так и неспецифических факторов резистентности (В. Вэйнштейн, 1984; С. Ватсон, 1987; С.С. Волков, 1999). При угнетении иммунной реактивности самок микрофлора способна вызвать нарушение пренатального развития зародышей (Н.Н. Михайлов, 1972).

Кроме того, при естественном осеменении коров спермии попадают в каудальный отдел шейки матки (А.Г. Нежданов, П.М. Торгун, 1993). Небольшая их часть (около 0,5%), преодолевая барьер из слизистого секрета, проникает в краниальный отдел цервикального канала, откуда быстро транспортируется к верхушкам рогов матки за счет антиперистальтической моторики полового тракта. Описанный механизм способствует продвижению спермиев по половым путям, одновременно препятствуя проникновению микробов (Ф.И. Осташко и соавт., 1972, 1977). При искусственном осеменении сперма впрыскивается в краниальную часть шейки матки или непосредственно в матку, минуя биологический барьер из цервикального секрета. Если при этом сперма содержит микробы, то создаются условия для быстрого обсеменения ими эндометрия, а, возможно, и полости яйцевода. По мере увеличения степени микробной контаминации спермы процент плодотворных осеменений уменьшается (В.К. Милованов, 1940, E.L. Willet, 1951; П.А. Волосков, 1965; Ф.И. Осташко, 1977).

Если в период течки, матка коровы устойчива к микробному фактору, то в лютеальную фазу полового цикла матка коровы чувствительна к нему. Это доказали Л. Роусон с сотрудниками (L.E. Rowson et al., 1953). Они одну группу коров осеменяли в лютеальную фазу цикла, другую – в эстральную, затем проводили бактериальную проверку спермы и смывов с шейки матки. Из 11 коров, осемененных в лютеальную фазу цикла, у 8 был пиометрит, у одной – стерильный метрит, у одной, осемененной в первый день после охоты, метрита не было, и еще у одной, осемененной на третий день после охоты, была пиометра. В сперме были обнаружены стафилококки в небольшом количестве. У других 6 коров, осемененных во время охоты, метриты не наблюдались, несмотря на то, что используемая сперма содержала C. Pyogenes.

А.В. Квасницкий (1988) в своей книге цитирует результаты эксперимента У. Такнасни, где было показано, что введение осеменительного инструмента в матку эстральной коровы не влияет на ее плодовитость, но аналогичная манипуляция в лютеальной фазе цикла снижает стельность реципиента до 33%, а при введении инструмента в защитном футляре в момент прохождения влагалища, результативность увеличивается до 59% (Y. Taknasni, 1981).

М. Кришна и соавторы провели исследования 106 коров, у которых брали пробы слизи из шейки матки в период половой охоты, от 86 были выделены различные бактерии. Другие авторы отмечают, что даже искусственно введенная в половые пути самок сельскохозяйственных животных условно патогенная микрофлора лизируется в течение нескольких суток (M. Krishna et al., 1974, цитата по книге Н. Михайлова, 1976).

С.А. Фолькель и соавт. внутриматочно вводили Вг.abortus. Смывы из матки и полученные эмбрионы при исследовании оказались свободными от вводимого штамма Вг. abortus. У одного животного, не проявившего охоту после суперовуляции в смыве из матки, обнаружили вводимый штамм Вг. Abortus (Voelkel S.A., et al., 1983).

У 16 искусственно зараженных бруцеллезом коров в университете штата Луизиана Вг. abortus отсутствовала в промывной жидкости и гомогенизированных эмбрионах (R. Bowen et al., 1983; Е. Singh et al., 1983). Таким образом, было подтверждено, что здоровая небеременная матка циклирующих коров подавляет размножение микроорганизмов.

П. Шпалюнг сообщает, что присутствие Вг. abortus в небеременных матках носит переходной характер и связано с бактеремической фазой. Она ограничивается или отсутствует из-за воздействия эструса (P. Sparling, 1986).

Пейн И.М. и соавт. получили Вг. abortus шт. 544 в небольших количествах из шейки матки 6/6 зараженных небеременных телок в течение 4 мес. после заражения. Это противоречит тезису о том, что микроорганизмы быстро выходят из небеременной матки животных с нормальным эстральным циклом (I. Payne et al., 1960).

Однако, в определенных условиях резистентность организма значительно ослабевает и нормальный количественный и качественный состав микрофлоры изменяется, а деятельность ее активизируется. Нарушение целостности защитных покровов кожи и слизистых оболочек также приводит к активизации деятельности сапрофитов, которые проникнув в глубь организма, вызывают развитие в нем болезнетворного процесса (Н.А. Мартыненко, 1971; Г.В. Зверева и соавт., 1987).

С другой стороны, у некоторых видов животных существует определенная зависимость чувствительности к маточным инфекциям от уровня стероидных гормонов крови. В частности, доказано, что матка коровы и кролика легко инфицируется в лютеальной фазе цикла и устойчива к заражению в эстральный период (Е. Виллет и соавт., 1951; В. Блэк и соавт., 1953; Л. Роусон и соавт., 1953; А.В. Квасницкий и соавт., 1988; Л.К. Эрнст и соавт., 1989). Своими опытами Блэк, Саймен и соавт. (1953) цит. по кн. Н.А. Мартыненко, 1971; James W. (1971), подтвердили наличие в эстральной матке высокоэффективного защитного механизма против инфекции. Они установили, что прогестерон способствует развитию инфекции, а эстрогены повышают резистентность матки к инфекциям.

Исследования Хока с сотрудниками (H. Hawk et al., 1959) показали, что в защитном механизме матки против инфекции тормозящее действие прогестерона играет большую роль, нежели стимулирующее действие эстрогенов.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6