Современная генетика
o s?pt?mвn?, iar peste оnc? o s?pt?mвn? se formeaz? aglomera?ii de celule,
apoi apare ?i callusul.
Pentru ca planta s? regenereze, celulele de callus se tranefer? оntr-un
mediu cultural special, care contribuie la diferen?ierea organelor. Оn
ultimii ani, din protopla?tii izola?i au fost ob?inute plante de tutun,
morcov, grвu, maz?re, vi??-de-vie ?. a.
Pentru regenerarea unei plante оntregi de tutun din protopla?ti e nevoie
de 7—10 s?pt?mвni.
Cultivarea protopla?tilor prezint? un mare interes pentru ingineria
genetic?. Оn primul rвnd, pentru c? cu ajutorul lor se pot оnmul?i repede
exemplare оntregi de plant?, deoarece din fiecare celul? se poate ob?ine un
оntreg organism. Dac? dintr-un gram de frunze verzi se pot separa
aproximativ dou? milioane de protopla?ti, se creaz? posibilit??i nelimitate
pentru clonarea plantelor, fapt ce are o mare importan?? economic?.
Оntreaga descenden?? ob?inut? din protopla?tii unei singure plante este
identic? din punct de vedere genetic, de aceea aceast? metod? de оnmul?ire
face posibil? men?inerea pentru un timp nelimitat a propriet??ilor de
valoare ale plantelor cultivate, ceea ce nu se poate ob?ine prin оnmul?irea
sexuat? obi?nuit?.
Оn rвndul al doilea, ?i aceasta prezint? cea mai mare importan??, cu
ajutorul protopla?tilor se pot ob?ine a?a-zi?ii hibrizi asexuali sau
somatici ai diferitelor forme de plante, care nu pot fi crea?i prin nici o
alt? metod?. Schema general? a hibridiz?rii celulelor somatice ?i de
ob?inere prin ele a hibrizilor asexuali este prezentat? оn des. 28.
Esen?a acestei tehnologii const? оn faptul c? drept materie ini?ial? de
construc?ie se utilizeaz? nu celulele sexuale, ci celulele somatice. Dup?
ce se оndep?rteaz? de pe ele membranele dure, acestea sunt silite s? se
contopeasc?. Din celulele hibride, ap?rute оn urma contopirii, se ob?in
apoi plante hibride.
Protopla?tii, datorit? lipsei membranei de celuloz?, pot s? se
contopeasc? singuri оntre ei sau acest proces se produce оn prezen?a unor
agen?i chimici, bun?oar? a polietilenglicolului. Dup? contopirea celulelor
urmeaz? contopirea nucleelor lor, apoi, оn cвteva zile, se restabile?te
membrana celular? comun? ?i, оn sfвr?it, celula hibrid? оncepe s? se
divizeze.
Оn anul 1972 un grup de savan?i americani, оn frunte cu P. Carlson, au
ob?inut primii hibrizi celulari prin contopirea protopla?tilor a dou?
soiuri de tutun. Din celulele contopite au regenerat plante hibride
normale— amfidiploide, care con?ineau cromozomii ambilor p?rin?i, 24 de la
nicotiana glauca ?i 18 de la nicotiana langsdorfi: оn total 2n = 42. S-a
constatat c? plantele hibride, ob?inute prin metoda contopirii
protopla?tilor, nu se deosebesc prin nimic de cele ob?inute prin
hibridizare sexual?.
Un grup de savan?i englezi, оn frunte cu E. Cocching, au ob?inut оn anul
1987 plante hibride prin оncruci?area a dou? specii de petunie.
Colaboratorii laboratorului de cultivare a celulelor ?i ?esuturilor de la
Institutul de fiziologie a plantelor al A? a fostei URSS, оn frunte cu R,
Butenco, au ob?inut hibrizi somatici din оncruci?area a dou? soiuri de
tutun, iar, datorit? muncii оn comun a savantului sovietic IU. Gleb ?i
savantului german F. Hofman, a fost creat? o plant? nou? — arabidobrassica.
?i ea a fost ob?inut? prin hibridizarea somatic? a arabidopsisului ?i a
uneia din speciile de varz? s?lbatic?. Noul hibrid a fost crescut оn trei
etape. La оnceput, dup? contopirea protopla?tilor celulelor somatice ale
arabidopsisului ?i a verzei au fost ob?inute celule hibride, care aveau
cromozomii ambelor plante ini?iale. Apoi prin оnmul?irea unor celule
hibride aparte оn condi?iile cultiv?rii sterile оn medii nutritive solide,
care con?ineau geloz?, vitamine, substan?e minerale ?i fitohormoni (auxina
?i chinina), au fost ob?inu?i callu?ii liniilor celulare respective. Оn
sfвr?it, оn etapa a treia, schimbвnd componen?a mediilor nutritive, se
provoca stimularea celulelor callusului pentru morfogenez?. Datorit?
acestei stimula?ii, celulele hibride ale unor linii formau numai r?d?cina,
ale alteia — numai l?starii, ale celor din urm? — plante оntregi cu
r?d?cini, l?stari ?i flori. Dar plantele оnflorite ale arabidobrassicii nu
erau capabile de polenizare. Reproducerea ?i оnmul?irea lor este posibil?
numai pe cale vegetativ? оn condi?iile cultiv?rii ?esuturilor.
Cercet?rile оn domeniul ingineriei celulare a plantelor au atins stadiul
cвnd se poate vorbi despre utilizarea acestei noi metode de hibridizare la
selec?ionarea practic? a plantelor, cu toate c? оn acest caz n-au fost
studiate оnc? definitiv particularit??ile principale ale «comportamentului»
genelor, a fost dovedit c? hibridizarea somatic?, spre deosebire de cea
sexual?, l?rge?te mult limitele оncruci??rii.
Hibridizarea celulelor somatice ?i-a dovedit de acum eficacitatea. Prin
ea au fost ob?inu?i hibrizi interspecifici ai cartofului, tomatelor,
turnepsului, verzei cu rudele lor s?lbatice, precum ?i hibrizi ai tutunului
?i mahorc?i, tomatului ?i cartofului, care prezint? un material ini?ial de
valoare pentru selectarea оn viitor a unor soiuri noi. Astfel la una din
experien?e savan?ii au utilizat protopla?tii unei specii s?lbatice ?i a
unei specii cultivate de cartofi — soiul Prieculischii timpuriu. Acest soi
are tuberculi mari, dar este predispus la boli. Cartoful s?lbatic are
tuberculi foarte mici, dar este rezistent la diferite boli. Aceste specii
se deosebesc ?i dup? m?rimea protopla?tilor, ?i dun? num?rul cromozomilor.
Ce propriet??i s-au ob?inut la hibrizii somatici? Dac? compar?m forma
frunzelor, a tufelor ?i m?rimea tuberculilor, acestea ocup? parc? o pozi?ie
intermediar? оntre speciile cultivate ?i cele s?lbatice. Tot a?a se
оntвmpla ?i la hibridizarea obi?nuit?, pe cale sexual?, a acestor plante.
Dar hibridul ob?inut din protonla?ti s-a dovedit a fi rezistent la una din
bolile virotice grave — la fitoftoroz?.
Оn cursul ultimilor ani s-au ob?inut celule hibride prin contopirea
protopla?tilor ?i оncruci?вnd reprezentan?ii unor specii foarte
оndep?rtate: p?pu?oiul cu ov?sul, morcovul cu tutunul, morcovul cu
petuniea, p?pu?oiul cu soia, maz?rea cu soia ?. a. m. d., dar din aceste
celule hibride nu s-au ob?inut оnc? plante оntregi.
Hibridizarea celulelor somatice, оn afar? de solu?ionarea problemelor
practice, deschide posibilit??i absolut noi оn ce prive?te studierea unei
astfel de probleme ?tiin?ifice fundamentale, precum este interac?iunea
оntre nucleu, citoplasm? ?i organitele celulei. Pвn? nu demult оnc?
selec?ia ?i genetica nu aveau posibilitatea de a reconstrui genele
organelelor citoplasmei, deoarece prin оncruci?area obi?nuit? ele se
mo?tenesc numai de la mam?. Fiind lipsite de genele citoplasmitice ale
organismului patern, оntre ele nu se poate produce nici o recombina?ie. Pe
de alt? parte, aceste gene sunt responsabile de o serie de procese practice
importante. Ingineria celular? ofer? pentru оntвia dat? posibilitatea de a
manipula ?i cu aceste gene.
12.4 Transferul interspecific al genelor
Ingineria genic? ca mijloc de creare ?i transferare a genelor noi e cea
mai potrivit? pentru practicarea metodelor ne tradi?ionale оn selec?ia
plantelor cultivate.
Ca оnceput al ingineriei genice a plantelor poate fi considerat?
descoperirea vectorului natural al plazmidei mari оn bacteriile de sol
Agrobacterium tumefaciens, care provoac? la plantele dicotiledonate
formarea unor tumori — a col?anilor crenela?i. Adev?ratele tumori apar la
plantele capabile s? creasc? nelimitat ?i compuse din celule ne
diferen?iate, dup? ce оn ?esutul v?t?mat nimeresc bacteriile A.
tumefaciens.
Оn anul 1974 s-a descoperit c? caracterul transform?rii este determinat
genetic de plazmida ce a c?p?tat de-numirea de Ti (de la cuvintele engleze
tumor inducing — care provoac? tumoare). Aceast? plazmid?, precum ?i
plazmida Ri (root inducing) — ce provoac? ro?ea??), care determin? boala
tumoral? a r?d?cinilor ?i care se afl? оn bacteria de sol оnrudit?
(Argobacterium rhizogenes) formeaz? temelia vectorului ce transport?
informa?ia genetic? str?in? оn celulele plantelor.
Plazmidele Ti se afl? numai оn celulele bacteriilor. Dup? ce p?trund оn
celulele vegetale, se produce inserarea unei p?r?i a ADN-ului plazmidic cu
ADN-ul cromozomic al noului st?pвn.
O condi?ie obligatorie a fiec?rei manipul?ri de inginerie genic? este
transferarea celulei unice datorit? inser?rii moleculei ADN ?i dup? aceasta
clonarea acestei celule. S-a constatat: celulele vegetale ?i protopla?tii
lor izola?i pot fi ?i ei clona?i. A fost elaborat? metoda de inserare a
plazmei Ti prin infectarea protopla?tilor cu bacteria A. tumefaciens.
Posibilitatea transform?rii plantelor superioare a fost demonstrat?
recent de savantul olandez F. Crens оmpreun? cu colaboratorii s?i pe baza
protopla?tilor frunzelor de tutun. Оn prealabil a fost оndep?rtat? cea mai
mare parte a membranei celulare cu ajutorul unor fermen?i speciali.
Protopla?tii ob?inu?i оn modul acesta erau transforma?i activ de c?tre
plazmida Ti.
Folosirea Ti — plazmidei оn calitate de vector pentru transferul genelor
оn celulele vegetale ofer? posibilitatea de a regenera plante оntregi din
celule separate, ce con?in ADN str?in. Pe aceast? cale оn anul 1985
savantul japonez M. Norimoto a reu?it s? transfere gena fazeolinei
(proteinei de rezerv? a boabelor de fasole) оn celulele florii-soarelui ?i
a tutunului. Aceast? gen? ?i-a men?inut capacitatea de a se replica оn
celulele str?ine, оn ele se sintetiza оn cantit??i mari ARNi ?i оns??i
fazeolina.
Un fenomen asem?n?tor a fost observat ceva mai оnainte (anul 1977) de un
grup de savan?i de la Universitatea din Wa?ington. M. Drumand, M. Gordon ?.
a. au stabilit c? оn caz de interac?iune a plazmidei Ti cu celulele
?esutului de tutun se produce transferul unui fragment de plazmid? din
celula bacterial? оn celula vegetal?, urmat? de copierea lui оn celulele
tumorii. A fost prima m?rturie clar? a posibilit??ii transcrierii оn
celulele ?esutului vegetal a ADN-ului de origine bacterial?.
Оn ingineriea genetic? a plantelor o deosebit? perspectiv? prezint?
cercet?rile de transplantare a unor gene aparte sau a unor grupuri de gene
de la unele specii la altele cu scopul de a le reconstrui genetic ?i a le
atribui noi caractere ?i оnsu?iri de valoare. Este vorba de asemenea
propriet??i cum ar fi capacitatea de sintetizare a aminoacizilor
indispensabili, a substan?elor cu activitate biologic?, rezisten?a fa?? de
d?un?tori ?i boli, precum ?i fa?? de pesticide, reac?ionarea la utilizarea
оngr???mintelor minerale, capacitatea de a absorbi azotul liber din aer ?i
multe altele. Atвt оn ?ara noastr?, cвt ?i peste hotare se efectueaz?
cercet?ri rodnice оn aceast? direc?ie.
La оnceputul deceniului al nou?lea savan?ii australieni au reu?it s?
transplanteze genele din bacterii оn celulele tomatului, iar biologii
englezi — оn celulele paltinului.
Lucr?ri analoge au fost realizate оn 1975 de c?tre colaboratorii
Institutului de biologie ?i genetic? molecular? a A? Ucrainene. Savan?ii
din Kiev ?i-au pus drept sarcin? transplantarea din celula colibacilului оn
celulele tutunului a unui grup de gene. Ca translator de gene a fost alee
fagul lambda. Acest fag paraziteaz? pe bacteriile colibacilului, insereaz?
ADN-ul s?u оn cel al st?pвnului, iar cвnd p?r?se?te celula bacteriei, duce
cu ea cвteva din genele ei — operonul lactozic.
Pentru experien?? a fost ales anume tutunul, pentru c? unele din celulele
lui cresc bine оn cultura de laborator ?i din ele se poate cre?te relativ
u?or o plant? оntreag?. Experien?a a decurs оn felul urm?tor: оn unele vase
se cre?teau celule de tutun, оn altele — celule bacteriene, purt?toare ale
fagului lambda. Apoi celulele bacteriilor, ce cre?teau de obicei la
temperatura de 30—37°C, au fost transferate оntr-un mediu cu temperatura
mai оnalt? (42°CE). Оn aceste condi?ii fagii parc? fac celula s? explodeze,
se arunc? din ea, duc cu ei un fragment de ADN al st?pвnului — operonul
lactoz?.
Dup? aceasta fagii оnc?rca?i cu gene str?ine sunt separa?i din cultura
de colibacili ?i adu?i оn cultura celulelor de tutun. Peste un anumit timp
оn celulele de tutun spore?te cu mult activitatea fermentului —
galactozidaza. Оnseamn? c? a оnceput s? func?ioneze operonul lactozic.
Sinteza fermentului bacterial оn celulele tutunului se produce tot mai
activ ?i spre sfвr?itul s?pt?mвnii a treia spore?te оn compara?ie cu
оnceputul experien?ei de 30—50 de ori. Aceast? problem? solu?ionat? cu
succes a avut un caracter pur didactic, ea era necesar? pentru
perfec?ionarea metodei. C?ci n-are nici un rost a se altoi tutunului
operonul de lactoz?: tutunul se poate lipsi de lactoz?.
Mai descriem o problem? asem?n?toare, оns? de mare importan?? practic?.
Boabele de grвu con?in pu?ini aminoacizi indispensabili — triptofan a c?rui
cantitate (?i оnc? a unui aminoacid indispensabil — lizin?) determin?
valoarea proteinei celulei vegetale. Aici programul de sintetizare este
оmprumutat de la aceea?i bacterie a colibacilului: ADN-ul ei con?ine ?i
operonul triptofanic — un complex alc?tuit din cinci gene оn care se afl?
codificat un ferment ce sintetizeaz? triptofanul. Dac? acest operon este
luat din bacterie ?i transferat оn ADN-ul grвului, apoi оn urma acestei
opera?ii de inginerie genic? grвul se оmbog??e?te cu triptofan. Primele
cercet?ri ne inspir? speran?a c? оn viitorul apropiat ?i aceast? opera?ie
se va solda cu succes
Comunicarea savan?ilor de la Universitatea San-Diego (California), f?cut?
recent, p?rea senza?ional?. Ei au reu?it s? separe din organismul
licuriciului gena responsabil? de activitatea celulelor, care radiaz?
lumina Acest? gen? a fost inserat? оn celula tutunului. ?i ce crede?i? Cвnd
din aceast? celul? a fost crescut? o plant? de tutun, aparatele au fixat c?
frunzele plantei radiau permanent o lumin? slab?. Dac? se va confirma
definitiv c? radia?ia de lumin? este o urmare a transplant?rii genei,
experimentul va fi considerat de savan?i drept o mare realizare a
ingineriei genice.
Un vis sacru al savan?ilor ce lucreaz? оn domeniul ingineriei genice ?i
celulare este transferarea оn celula plantei a genelor responsabile pentru
оnsu?irea azotului molecular din aer. Aceste gene (nif — operon) le au
unele bacterii ?i alge euglenofite. Datorit? lor aceste organisme au o
garnitur? de fermen?i necesari, оntre care rolul principal оi apar?ine
nitrogenazei. Toate celelalte organisme nu dispun de aceste gene. De aceea
plantele care se scald? оn azot ?i sunt «оmbibate» cu el (4/5 de aer) au
nevoie, totu?i, ca solul s? con?in? compu?i ai acestui element. Pentru a
sintetiza proteine ?i alte substan?e plantele pot utiliza azotul numai оn
form? de compu?i chimici. ?i nu-i deloc оntвmpl?tor c? pentru a ob?ine
recolte maximale omenirea a creat o puternic? industrie de оngr???minte de
azot ?i este nevoit? s? cheltuiasc? оn aceste scopuri multe resurse
materiale.
Dar exist? ?i plante capabile s? оnfrunte оntr-o anumit? m?sur? aceste
dificult??i: este vorba de plantele leguminoase pe r?d?cinile c?rora
locuiesc a?a-zisele bacterii de nodozit??i care asimileaz? azotul din aer.
Astfel, leguminoaselor li se transmite o parte din azotul necesar оn urma
simbiozei cu bacteriile.
La оnceput savan?ii au оncercat s? modeleze un proces de simbioz?
asem?n?tor la cultivarea ?esutului vegetal. P. Carlson ?i colaboratorii s?i
au utilizat cultura ?esutului de morcov, deoarece pentru el erau deja
elaborate metodele de regenerare din celule ale plantei de valoare
complect?.
Оn cultura ?esutului de morcov se insera tulpina bacteriei de nodozit??i
(Azotobacter vinelandi) care nu poate cre?te f?r? adenin?. Оn mediul
nutrit1iv nu era aceast? substan??, de aceea bacteriile puteau s-o capete
numai din celulele morcovului. Dup? o cre?tere comun? timp de 12 zile,
celulele erau transferate оntr-un mediu f?r? azot, pe care peste cвteva
luni au crescut ni?te culturi capabile s? creasc? оncet оn cursul unui an
?i jum?tate. Culturile de control (f?r? azotobacterii) n-au crescut deloc
оntr-un astfel de mediu.
Colaboratorii Institutului de biologie ?i genetic? molecular? a A?
Ucrainene au ob?inut o simbioz? asem?n?toare. Оn acest scop ei au folosit
un alt gen de bacterii fixatoare de azot —Rhizobium, precum ?i celule de
tutun ?i de grоu. Ei au amestecat celulele bacteriene ?i vegetale, ?i peste
un timp oarecare s-au convine c? оn celulele de tutun ?i de grвu au p?truns
bacterii ?i c? ele sunt responsabile de fixarea azotului.
Оn ultimul timp au fost elaborate metode de contopire a algelor
euglenofite cu protopla?tii plantelor. O aten?ie special? o merit?
contopirea algei Giloeocapsa cu protopla?tii de tutun ?i de porumb. Aceast?
alg? prezint? interes nu numai prin faptul c? fixeaz? azotul atmosferic,
dar ?i prin aceea c?, spre deosebire de celelalte euglenofite, nu eman?
toxine pe parcursul activit??ii sale vitale.
Оn ultimii ani savan?ii englezi au reu?it s? separe gene ce determin?
capacitatea de fixare a azotului din microorganismul Klebsiella ?i s? le
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38
|