Современная генетика

specii de alge, care ar avea capacitatea de a absorbi selectiv cationii

diferitelor s?ruri pentru a face potabil? apa marin?.

A face potabil? apa marin? este una dintre problemele cele mai arz?toare,

care se afl? оn centrul aten?iei unui comitet special al ONU. Cu fiece an

pe planeta noastr? se resimte tot mai mult deficitul de ap? potabil?.

Pentru a ne imagina mai bine acest deficit, vom aduce urm?torul exemplu: оn

lacul Baical sunt concentrate peste 20% din rezervele de ap? potabil? din

lume. ?i peste 80% din cele ale fostei URSS. Doar no?iunea de «ap?

potabil?» include to?i ghe?arii, toate rвurile, apele subterane.

Unele din proiectele ingineriei genice enumerate mai sus par a fi

rezolvabile chiar ast?zi, altele ?in de domeniul fantasticii, dar progresul

tehnico-?tiin?ific, precum s-a dovedit de nenum?rate ori, apropie de

realizare chiar cele mai fantastice planuri.

Direc?iile ?tiin?ifice fundamentale, care au fost elaborate relativ nu

demult оn acest domeniu de cercet?tori, sunt ingineria celular?, ingineria

cromozomic? ?i ingineria genic?. Ele pot fi, pe drept cuvвnt, numite c?i

magistrale ale ingineriei genetice.

Ingineria celular? are scopul de a ob?ine unele plante оntregi din

protopla?ti izola?i, sau, precum le numesc savan?ii, «plante din eprubet?»;

cultivarea celulelor vegetale оntr-un mediu nutritiv artificial, pentru

ob?inerea оn mod accelerat a unui volum mare de mas? biologic? din care se

vor extrage ulterior variate substan?e biologice active; cultivarea оn

comun a protopla?tilor («celulelor goale») pentru a se ob?ine a?a-zi?ii

hibrizi asexua?i sau somatici, care оmbin? caractere de valoare ale

diferitelor specii, genuri ?i chiar familii de plante.

Ingineria celular?, fiind aplicat? la animale, ar permite utilizarea

celulelor sexuale ?i somatice (corporale), precum ?i a zigo?ilor (ovulii

fecunda?i) ?i germenilor precoci ai unor reproduc?tori ce se disting prin

indicii lor geneticii, pentru accelerarea procesului de ob?inere a unor

rase de mare randament.

Ingineria cromozomic? о?i propune transferarea unor cromozomi de la unele

specii de organisme la altele pentru a le transmite noi tr?s?turi utile.

Aceasta se mai ocup? ?i de metodele de ob?inere a hibrizilor dep?rta?i

fecunzi de plante ?i chiar de ob?inerea unor specii noi prin m?rirea оn

celulele lor a garniturilor de cromozomi.

Ingineria genic? este calea magistral?, prospectul central al ingineriei

genetice, deoarece anume pe aceast? cale au fost ob?inute rezultatele cele

mai nea?teptate, cu privire la reconstruirea genomilor din celulele

microorganismelor, plantelor ?i animalelor.

Prin metoda ingineriei genice se sintetizeaz? gene noi, se realizeaz?

transmutarea ?i inserarea lor оn genomurile organismelor, se ob?ine оn ele

expresia genelor str?ine. Ingineria genic? va face posibil? ?i vindecarea

oamenilor de numeroase defecte ereditare.

10.3 Separarea ?i sinteza artificial? a genelor

Pentru a оnzestra un organism ne cale artificial? cu noi propriet??i,

trebuie s? introducem оn el o nou? gen? sau un grup de gene, ce ar

func?iona acolo, adic? ar produce proteine. Gena necesar? se ob?ine «оn

form? pur?» prin cвteva metode. Cel mai des ea este separat? direct din

ADN.

Aceast? procedur? se realizeaz? cu ajutorul a dou? opera?ii de baz?,

care pot fi denumite simplu «sec?ionare» ?i «suturare». Rolul de

instrumente оl joac? ni?te proteine speciale - fermen?ii, care-s

catalizatori biologici ai diferitelor procese ?i reac?ii, ce se produc cu

moleculele оn celule. Exist? un grup de fermen?i, care au o ac?iune

specific? asupra ADN-ului ?i se utilizeaz? pe larg оn ingineria genetic?.

Ace?tia sunt: restrictazele, ADN-ligazele, revertazele, transferazele

terminale ?. a. m. d. Cel mai des sunt utilizate оn acest scop

restrictazele ?i ligazele. Restrictazele func?ioneaz? ca ni?te «foarfece»

moleculare, iar ligazele, dimpotriv?, unesc оntr-un tot оntreg moleculele

t?iate de ADN.

Restrictazele, ac?ionвnd asupra catenei de ADN, recunosc o anumit?

succesiune de nucleotide. Оn fig. 21 este prezentat schematic sectorul

molecular ADN cu dou? catene. Restrictaza, numit? Hind II, «recunoa?te»

succesiunea compus? din ?ase nucleotide GTC, GAC, pe care o taie exact la

mijloc.

Restrictaza cu denumirea conven?ional? RI «recunoa?te» o alt? succesiune

a nucleotidelor GAA TTC ?i «taie» ADN-ul оn acest loc asimetric, «оn

trepte». La fel de asimetric, dar оn alt? direc?ie ADN-ul este t?iat de

restrictaza PstI ?. a. m. d. Toate aceste fragmente t?iate pot fi suturate

din nou оntr-un tot оntreg de fermentul ligaza. Оn prezent cunoa?tem peste

patru sute de restrictaze ?i lista lor se completeaz? mereu. Cu ajutorul

fermen?ilor polii fragmentelor ADN pot fi lungi?i, din ei pot fi

оndep?rtate sectoare aparte, ADN-ul poate fi t?iat exact оn locul necesar,

adic? genele pot fi separate, croite ?i recroite dup? voia

experimentatorului, ceea ce este foarte important pentru construirea

moleculelor de ADN hibride sau recombinante.

Deoarece savan?ii dispun de un num?r limitat de gene pentru ob?inerea

moleculelor recombinante, ei utilizeaz? оn calitate de surse de gene, оn

primul rоnd, ADN-ul total, fragmentat sau t?iat оn segmente aparte de

fermen?ii restric?iei. Aceast? metod? a fost numit? metoda fragment?rii.

Datorit? ac?iunii restrictazelor ADN-ul se scindeaz? оn numeroase

fragmente, unele dintre ele con?inвnd gene.

Popula?ia acestor molecule de ADN este multiplicat? оn sistemul

bacterial, dup? care se selecteaz? genele necesare. La selectare este

folosit de obicei ca prob?-test ARNi radioactiv, sau copia ADNc, care

corespunde acestei gene. Aceast? metod? permite separarea atвt a genelor

ce se repet?, cвt ?i a genelor unice. Dificult??ile legate de selectarea

genelor unice se datoresc concentr?rii lor mici оn ADN-ul total. Astfel,

bun?oar?, printre fragmentele de ADN total un fragment de gen? unic? revine

la un milion de toate celelalte fragmente.

Оn prezent din ADN-ul total al unei serii de obiecte au fost separate

genele structurale. S. Cohen ?i D. Hogness оmpreun? cu colaboratorii lor au

separat pentru prima oar? din ADN-ul ariciului-de-mare ?i drosofilii cloni,

care con?in gene histonice ?i ribozomice.

La Institutul de biologie molecular? al A? al fosteо URSS (laboratorul

lui G. Gheorghiev) оn colaborare cu Institutul de energie atomic? I. V.

Curceatov (V. Gvozdev ?i colaboratorii s?i) s-a ob?inut prin intermediul

acestei metode o serie de gene structurale din ADN-ul drosofilei. Deoarece

acest obiect a fost bine studiat din punct de vedere genetic, prezint?

interes determinarea direct? a localiz?rii ?i func?iei posibile оn cromozom

a genelor separate.

Savan?ii au оnv??at nu numai s? separe din ADN gene ale diferitelor

organisme, dar ?i s? sintetizeze gene artificiale. Prima gen? artificial?,

care a оnceput s? func?ioneze, a fost sintetizat? de un grup de

colaboratori ai Institutului tehnologic din Massaciusets (SUA) оn frunte cu

X. Khorana - laureat al Premiului Nobel. Acasta a fost gena ARNt al

tirozinei.

Оn anul 1970 la Simpoziumul interna?ional de chimie ai compu?ilor

naturali din ora?ul Riga X. Khorana a f?cut o comunicare cu privire la

sintetizarea p?r?ii structurale a unei alte gene - ARNt al alaninei.

Acestei gene оi lipseau, оns?, оnc? cвteva p?r?i componente, ?i de aceea n-

a putut func?iona оn celule str?ine. Tot atunci colaboratorii laboratorului

lui X. Khorana au reu?it s? sintetizeze un segment din 85 de perechi de

nucleotide, care corespundea succesiunii ini?iale a ARNt-ului tirozinei.

Dar ?i aceast? gen? ca ?i cea a ARNt-ului alaninei s-a dovedit biologic

inactiv?.

Mai curвnd s-a clarificat una din cauzele e?ecului - оn celul? se

sintetizeaz? la оnceput ARNt-ul precursor compus din 126 de nucleotide.

Dup? aceasta un ferment special taie o parte din molecula precursoare ?i

abia atunci se transform? оn molecul? lucr?toare. A fost determinat?

succesiunea acestei precursoare ?i sintetizat segmentul respectiv de ADN

compus din 126 perechi de nucleotide. Dar nici Aceast? gen? nu era activ?

din punct de vedere biologic.

?i aici a devenit limpede c? gena artificial? nu va putea func?iona оn

celul?, dac? nu va fi оnzestrat? cu sectoare de reglare - cu promotorul

care pune оn func?iune sinteza ARNt-ului ?i terminatorul care pune cap?t

sintezei. A fost nevoie de metode speciale pentru a determina succesiunea

acestor sectoare de reglare. S-a constatat c? promotorul con?ine 59 perechi

de nucleotide, iar terminatorul - 21 de perechi. A fost sintetizat? o gen?

complicat? cu promotor ?i terminator. Ba chiar mai mult, pentru ca celula

s? nu recunoasc? оn gen? un str?in, s-a decis c? ea s? nu se plimbe la

voie, c? ea trebuie suturat? оn ADN-ul celulei. Оn acest scop la ambele

poluri ale genei sintetizate au fost unite capete «lipicoase» cu un singur

filament. Tocmai aceste poluri se formeaz? оn ADN, cвnd fermentul

restrictaza оl taie оn buc??i.

Dac? se va ac?iona asupra ADN-ului cu restrictaza, iar apoi se va ad?uga

gena sintetic?, capetele ADN-ului ?i ale genei se vor lipi unul de altul ?i

gena se va оncorpora оn ADN. R?mвne doar de suturat jonc?iunile cu

fermentul ligaza. Savan?ii au procedat tocmai a?a. ?i... iar au e?uat.

Bacteria E. coli n-a receptat gena str?in?. Cercet?torii erau aproape

dispera?i. ?i atunci au оncercat s? sutureze gena nu оn ADN-ul

colibacilului, ci оn ADN-ul unuia din virusurile, care se оnmul?esc оn

aceast? bacterie. De data aceasta savan?ii au lucrat bucurвndu-se de

succes: dup? ce celula colibacilului a fost infectat? cu virusul, оn gena

c?ruia a fost оncorporat? gena artificial?, bacteria a оnceput a sintetiza

ARNt-ul codificat оn aceast? gen?.

A?a dar, a оnceput a func?iona prima gen? sintetic?.

De atunci familia genelor sintetice artificiale cre?te mereu. Оndat? ce a

fost descoperit fenomenul reverstran-scrip?iei, adic? procesul de

transferare a informa?iei genetice de la ARN la ADN, savan?ii au оnceput s?

vorbeasc? despre posibilitatea unei noi c?i, fermentative, de sinteza

genei.

Pentru aceast? sintez? serve?te ca matri?? ARN-ul, care se elaboreaz? оn

celul? ?i prezint?, precum ?tim, o copie complementar? a unui fragment

anumit al ADN-ului. Dup? ce am separat acest ARNi, putem ob?ine prin

transcriere invers? o molecul? de ADN complementar? ei. Probabil c? ea va

fi o copie fidel? a genei ini?iale.

Primele experien?e reu?ite de sintetizare fermentativ? a genei au fost

efectuate оn laboratoarele din str?in?tate оn anul 1972.

Оn anul 1973 L. Chiseliov ?i L. Frolova, colaboratori la Institutul de

biologie molecular?, precum ?i C. Gazarean ?i V. Tarantul de la Institutul

de energie atomic? «Curceatov», dirija?i de academicianul V. A. Enghelgard,

au ob?inut partea informatic? a genei, globina, utilizвnd matri?a ARNi-ului

globinic din celulele porumbelului.

Оn acest timp оn cadrul proectului «revertaza» a activat ?i un alt grup

de savan?i - V. Cavzan ?i A. Rвndici de la Institutul de biologie

molecular? ?i genetic? al A? Ucrainene, care au reu?it ?i ei s? sintetizeze

gena globin?, utilizвnd drept matri?? ARNi-ul globinic al iepurelui de

cas?, nu al porumbelului.

Оn anul 1979 s-au soldat cu succes lucr?rile de sintetizare a genelor de

bradichinin?, datorit? eforturilor comune ale savan?ilor de la Institutele

de genetic? general? ?i de chimie bioorganic? ?i de anghiotenzin? - de

c?tre savan?ii Institutului de citologie ?i genetic? al A? a Federa?iei

Ruse.

Оn anul 1981 la Institutul de biologie molecular? un grup de colaboratori

(S. Deev, N. Barbacari, O. Poleanovschii ?. a.) au sintetizat ?i au

transferat оntr-o celul? bacterian? o gen? care codifica una din catenele

u?oare ale imunoglobulinei. Mai tвrziu оn ?ara noastr?, cвt ?i оn

laboratoarele str?ine au fost sintetizate multe gene: a somatostatinei,

somatotropinei, insulinei, interferonului ?. a. care ?i-au g?sit aplicare

larg? оn practic?.

10.4 Clonarea genelor

Genele separate din alte organisme sau sintetizate artificial pe cale

chimic?. fiind transferate оn celule noi, nu sunt оn stare s? se reproduc?

nici s? se transmit? descenden?ei acestor celule. Acest lucru se poate

ob?ine, dac? ele se vor introduce оn prealabil оn componen?a structurii

genetice, care are un aparat propriu de reproducere. Оn ingineria genetic?

aceast? structur? este cu adev?rat figura central? оn toate manipul?rile

ingineriei genice. poart? numele de vector, sau «transportor».

Vectorul este o molecul? de ADN capabil? s? transfere оn celul? o gen?

str?in? ?i s? asigure acolo оnmul?irea ei, sintetizarea produsului proteic

?i оncorporarea оn cromozom.

De cele mai multe ori оn calitate de vector sunt utilizate plazmidele

bacteriilor, virusurile bacteriilor (bacteriofagii) ?i virusurile

animalelor, precum ?i cosmidele, care con?in elemente genetice ale

plazmidelor ?i ale bacteriofagilor.

Molecula-vector trebuie s? aib? capacitatea de replicare autonom? ?i s?

con?in? anumite gene de semnalare (marcatori), bun?oar? gene de rezisten??

la antibiotice, care permit descoperirea ?i identificarea celulelor

modificate.

Plazmidele sunt larg r?spвndite оn lumea bacteriilor. Sunt, precum s-a

notat mai sus, mici molecule inelare de ADN, care se afl? оn celulele

bacteriale. Poate fi o molecul? sau cвteva. Plazmida con?ine genele

necesare pentru reproducerea ADN-ului ?i genele rezistente la antibiotice,

de exemplu la ampicilin? ?i tetraciclin?, precum vedem оn fig. 22.

Оn interiorul acestor gene se afl? fragmente pe care le recunosc

restrictazele. Asemenea fragmente exist? bineоn?eles ?i оn alte locuri ale

plazmidei, dar cele din interiorul genelor de rezisten?? sunt deosebit de

importante, deoarece anume acolo se insereaz? ADN-ul str?in. Gena este

v?t?mat? ?i bacteria care con?ine o astfel de molecul? hibrid? devine

incapabil? s? opun? rezisten?? ac?iunii antibioticicor. Aceast?

particularitate permite selectarea pentru оnmul?irea continu? numai a

bacteriilor care con?in molecula hibrid? sau molecula recombinant? de ADN.

A?a dar, moleculele recombinate con?in gene care trebuie оnmul?ite ?i

vectorii cu ajutorul c?rora se realizeaz? acest proces.

To?i vectorii plazmidici utiliza?i оn ingineria genetic? sunt crea?i pe

cale artificial? prin reunirea unor p?r?i aparte a diferitelor plazmide

naturale.

Unele plazmide au o particularitate foarte important?: dac? asupra

celulelor оn care exist? acest vector se va ac?iona cu antibioticul

cloramfenicol, оn ele num?rul copiilor de plazmid? va spori pвn? la 1-3

mii. Astfel se m?re?te doza genei necesare. ceea ce permite a se ob?ine

gena оncorporat? оn plazmid? (sau produsul acestei gene) оn mari cantit??i.

Dar cum se ob?ine o molecul? recombinat?? Cum se realizeaz? clonarea

(inserarea) genei str?ine оn plazmid?? Principalele opera?ii ale acestui

proces sunt indicate оn fig. 23.

Оn acest scop trebuie s? avem un ADN al plazmidei - vector (de exemplu P1

?i ADN-ul organismului care ne intereseaz?. ADN-ul plazmidic ?i cel str?in

este tratat cu restrictaz? (bun?oar? Bam1), dup? care la plazmid? оn gena

de rezisten?? fa?? de tetraciclin? se formeaz? o ruptur? ?i moleculele

inelare se transform? оn liniare. Apoi ambele preparate scindate ale ADN-

lui se amestec? unul cu altul ?i sunt tratate cu ligaz?. Fragmentele de ADN

se unesc ?i formeaz? plazmida recombinant? sau un ADN hibrid.

Dup? aceasta urmeaz? procedura de selectare a acestor molecule hibride:

tot amestecul de molecule prelucrate cu ligaz? se introduce оn celulele

bacteriale. Apoi aceste celule sunt a?ezate оntr-un mediu nutritiv solid cu

antibioticele ampicilin? ?i tetraciclin?. Celulele care con?in plazmida

hibrid? vor cre?te оn mediul cu ampicilin?, dar nu vor cre?te оmpreun? cu

ambele antibiotice, deoarece gena rezisten?ei din plazmida tetraciclinei a

fost defectat? de inser?ie.

Cre?terea selectiv? permite colectarea celulelor ce con?in molecula

hibrid? ADN. Оn continuare ele se оnmul?esc ?i ADN-ul recombinant, ob?inut

din ele оn cantit??i mari, este utilizat оn diferite scopuri.

A?a dar, din momentul introducerii ADN-ului recombinant оn celul? оncepe

clonarea molecular?, adic? ob?inerea urma?ilor moleculei recombinate,

create оn mod artificial. Оn acest scop pentru celulele transformate sunt

create condi?ii specifice оn vederea select?rii lor, ?inвndu-se seama de

marcatorii geneticii, care semnaleaz? prezen?a celulelor pentru selec?ie.

Drept urmare se ob?ine o tulpin? absolut omogen?, din care, оn dependen??

de scop, se separ? ori gena clonat?, ori produsul ei.

Acestea sunt оn linii generale bazele teoretice ale ingineriei genetice.

Ingineria genetic? face abia primii pa?i, dar de acum ast?zi putem vorbi

despre perspectivele aplic?rii realiz?rilor ei оntr-o serie de domenii din

sfera material?. Оn etapa actual? cea mai larg? aplicare o are ingineria

genetic? a microorganismelor.

XI. INGINERIA GENETIC? LA MICROORGANISMELE INDUSTRIALE

11.1 Activitatea enigmatic? a microorganismelor vii

La majoritatea oamenilor no?iunea de «microb» sau «bacterie» se asociaz?

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38