Механизмы устойчивости опухолей к цисплатину

металотеонеіни зв`язуються з електрофільними протипухлинними

препаратами типу цисплатина, а також мелфаланом та деякими

антибіотиками: адріаміцином, блеоміцином та доксорубіцином.

Клітини, що гіперексперсують металотеонеіни, часто резистентні

до дії цисплатина [50,51]. Однак металотеонеін не є обов`язковим

компонентом резистентності до цього препарату, оскільки зустрічаються

резистентні до цисплатина клітинні лінії, в яких металотеонеін не

виявляється [43].

При обробці цисплатином резистентних до препарата клітин з

підвищеним вмістом металотеонеіна 70% внутрішньоклітинної платини

знаходять у зв`язаному з білком стані.

Досліди по трансфекції гена металотеонеіна ІІа показали, що

клітини-трансфекти набувають резистентності до цисплатина,

хлорамбуцила та мелфалана [52].

Добре виражена експресія металотеонеіна в пухлинах може мати

прогностичне значення. Наприклад, при лікування хворих на рак

стравоходу за допомогою цисплатина 5-річна життєздатність пацієнтів з

металотеонеін-від`ємними пухлинами становить 56%, а пацієнтів з

металотеонеін-позитивними пухлинами – 26% [53].

З наведених вище даних можна заключити, що у випадках

підвищеної експресії металотеонеін є важливою складовою

резистентності до цисплатина.

4.3.Репарація пошкоджень ДНК.

Резистентність клітин до дії цисплатина може залежати від стану

системи репарації пошкоджень ДНК.

Один з механізмів резистентності клітин до цисплатину –

прискорена репарація цисплатин-ДНК-адуктів [54]. Чутливі до дії

цисплатина клітинні лінії відрізняються зниженою здатністю

ліквідувати основні адукти ДНК та цисплатина (GG-Pt та GA-Pt), а

також послабленою активністю ДНК-полімераз [55,56]. Обробка

резистентних до цисплатина клітин афідикоіном – інгібітором ДНК-

полімераз ? та ? повертає чутливість до цисплатина, що стверджує

роль репарації адуктів цисплатин-ДНК у формуванні резистентності

[57].

На сьогодні мало відомо, щодо ліквідації продуктів платинування

ДНК у мітохондріях. Вважають, що мітохондріальна ендонуклеаза G (Endo

G) може брати участь у репаративних процесах цих органел [58].

Нещодавно з культуральної рідини пухлинних клітин та

біопсійного матеріалу пухлин людини були виділені білки HMG (high-

mobility group) та їм подібні, які зв`язуються з ДНК, що пошкоджена

цисплатином, але не трансплатином чи ультрафіолетовим випроміненням

[59,60]. Ці білки – висококонсервативні, локалізуються у цитоплазмі

та ядрі клітини. Їх біологічна роль ще точно не встановлена.

Інтенсивність зв`язування ДНК з цисплатином та HMG-подібними білками

прямо пропорційна ступеню пошкодження ДНК. ДНК резистентних клітин

зв`язується з цими білками більш ефективно. HMG-білки взаємодіють з

платинованою ДНК, закривають пошкоджені сайти від ферментів

ексцизійної репарації. Припускають, що зв`язування HMG-подібних

білків з пошкодженою ДНК може викликати зупинку реплікації чи

транскрипції, а також впливати на роботу систем контролю клітинного

циклу при руйнуванні ДНК.

Відомо, що такі дефекти системи репарації невідповідностей

(mismatch repair), як недостатня експресія білків hMSH2 чи hMLH-1,

призводять до виникнення резистентності до цисплатина [61,62]. MSH2-

білок сам по собі чи разом з білком GTBP/p160 розпізнає невеликі

зміни у ланцюгу ДНК, наприклад, продукти платинування ДНК, і

зв`язується з ними.

Априорі можна було б припустити, що відсутність якої-небудь

частини системи репарації ДНК сприяє розвитку гіперчутливості до дії

цисплатина, що відбувається у клітинах, дефектних за системою

ексцизійної репарації. Але у випадку порушення функції системи

mismatch repair клітина набуває резистентності до цисплатина. Цей

феномен можна розглядати з двох позицій. По-перше, порушення системи

mismatch repair може бути наслідком індукованого цисплатином

випадкового мутагенезу, що в результаті обумовлює стійкість до дії

цисплатина. По-друге, саме дефект у роботі цієї системи репарації

може покласти початок резистентності [63,64].

Комплекс білків репарації “розпізнає” адукти у ланцюгу-шаблоні

ДНК та намагається виправити ланцюг, що синтезується [65]. Так, поки

існує адукт у ланцюгу-шаблоні, а підбір нових основ не ліквідує

невідповідність, що існує, генерується сигнал, який запускає програму

апоптозу. Якщо система mismatch repair не працює, такий сигнал не

генерується, клітини стають толерантними до адуктів цисплатин-ДНК та

набувають резистентного фенотипу.

У випадку порушення системи ексцизійної репарації

спостерігається протилежний ефект. Клітини, дефектні по системі

ексцизійної репарації значно більш чутливі до дії цисплатина, ніж

нормальні клітини [66].

Показано, що цисплатин індукує експресію важливого для

ексцизійної репарації гена ERCC-1. Але до активації гена ERCC-1

відбувається активації генів c-fos та c-jun, а також фосфорилювання

білка c-Jun [67].

Нещодавно був відкритий новий ген BRCA1, повязаний з репарацією

пошкодженої ДНК. Показано, що гіперекспресія цього гена в клітинах

рака яєчника та молочної залози асоційована з резистентністю до дії

цисплатина [68].

Топоізомерази І та ІІ, що релаксують спіралі ДНК, є важливими

ферментами реплікації, транскрипції та рекомбінації. Вони відіграють

суттєву роль у процесах усунення адуктів ДНК-цисплатин. У багатьох

резистентних до дії цисплатина клітинах спостерігається підвищена

активність топоізомерази ІІ [69]. Інгібітори топоізомераз І та ІІ:

етопозид, камтотецин, СРТ-11, SN-38, новобіоцин – викликають

сенсибілізацію резистентних клітин до дії цисплатина [70-72].

Ще одним механізмом резистентності до цисплатина на рівні ДНК

може бути підвищена концентрація в клітині вільних нуклеотидів

(наприклад, АТФ, АДФ), які конкурують з ДНК за зв`язування з

цисплатином [73]. Таким чином, вільні нуклеотиди, концентрація яких у

цитоплазмі відрізняється в різних клітинах, можуть значно впливати на

чутливість пухлин до цисплатина.

Важливо також розглянути утворення зшивок ДНК-білок під дією

цисплатина. Хоча кількість цих адуктів набагато менше, ніж у разі між-

та внутри- ланцюгових зшивок, але відмічено, що вони також

відповідальні за цитотоксичний ефект цисплатина. Наприклад, було

показано, що одна резистентна до дії цисплатина клітинна лінія раку

яєчника утримувала у 6 разів менше цитокератина 18, ніж чутлива

лінія. Трансфекція кДНК цитокератина 18 в клітини резистентної лінії

давала клони з підвищеним рівнем цього білка та у більшості випадків

з чутливим фенотипом. При цьому було встановлено, що після обробки

цисплатином, з ДНК у клітинах зв`язуються негістонові білки. Пізніше

ці білки було ідентифіковано як цитокератини [74]. Можливо, що

формування зшивок цитокератин-ДНК, асоціюється з цитотоксичністю

цисплатина. Тоді зменшення продукції цитокератина 18 у резистентних

клітинах веде до зменшення кількості зшивок білок-ДНК та, як

наслідок, зниження чутливості до цисплатина.

Виходячи з вищенаведеного, можна заключити, що резистентність

до дії цисплатина на рівні ДНК обумовлена підвищеною активністю

систем репарації клітини чи її толерантністю до існуючих ДНК-Pt-

адуктів.

4.4.Зміни генома, що асоційовані з резистентністю до

цисплатина.

Оскільки клітинна резистентність є стійко спадковою ознакою в

ряду поколінь, можна зробити висновок, що стійкість до дії цисплатина

визначається генетичними особливостями клітини.

Встановлено, що основна роль в цьому феномені належить 11-й та

16-й хромосомам у людини [75]. На клітинних гібридах з різним

хромосомним складом було показано, що обовязковою умовою

резистентного фенотипа є наявність 16-ї хромосоми з резистентних

клітин та 11-ї хромосоми з чутливих клітин. При цьому основну роль

грає 16-та хромосома, а 11-та хромосома необхідна для її нормального

функціонування. Ці хромосоми залучені у різні боки резистентності. На

16-тій хромосомі присутні гени MRP (multidrug resistance associated

protein), LRP (lung resistance protein), гени додаткового білка

ексцизійної репарації-4, металотеонеіна. На 11-їй хромосомі

розташовані гени, що кодують глутатіон трансферазу ? (ГSТ-?), а також

протеін, що розпізнає специфічні послідовності пошкодженої ДНК.

Чутливість пухлинних клітин до дії цисплатина може залежати від

функціональної активності генів р 53 та генів родини bcl.

На сьогодні все ще залишається відкритим питання про зв`язок

лікарської резистентності з р 53-статусом клітин. Невизначеність тут

існує тому, що роль білка Р 53 у хемочутливості клітин до лікарської

терапії розглядають з двох протилежних точок зору: 1) експресія білка

Р 53 дикого типу (wt p 53) збільшує чутливість до хіміотерапії

шляхом прискорення входження клітин в апоптоз; 2) білок wt P 53

зменшує хемочутливість, оскільки після пошкодження ДНК обумовлює

зупинку росту для репарації ДНК [76].

Відомо, що після дії цисплатина у чутливих клітинах

збільшується рівень експресії гена р 53 та відповідно – білка Р 53. Р

53 індукує експресію білка р 21/WAF1/CIP1-інгібітора циклін залежних

кіназ, що грає важливу роль у зупинці клітинного циклу у G1-фазі

після генотоксичного стресу [77,78]. Під час цієї зупинки клітиною

приймається “рішення”: репарувати ДНК чи входити в апоптоз, в

залежності від глибини пошкодження. На сьогодні ще невідомі усі

біохімічні подробиці того, як активація р 53 ініціює апоптоз.

Більшість робіт по вивченню функціональної активності Р 53 у

резистентних до дії цисплатина клітинах засвідчують, що мутації гена

р 53 призводять до розвитку резистентності до хіміотерапії [79-82].

Показано, що в резистентних клітинах часто порушена

внутрішньоклітинна локалізація білка Р 53 [83] а також не

відбувається індукція експресії Р 53 та р 21 цисплатином [84,85].

Досліди по трансфекції гена р 53 також довели, що перенос у дефектні

за функцією Р 53 чи null-клітини wt p53-гена обумовлює збільшення

чутливості до лікарських препаратів, а трансфекція мутантного гена

mut p 53 спричиняє розвиток резистентності [86].

Досліджено, що в клітині після дії цисплатина разом з р 53

індукується експресія гена mdm 2. Продукт даного гена відрізняється

властивістю утворювати комплекси з білком Р 53 , таким чином

дезактивуючи частину внутрішньоклітинного Р 53. В резистентних до

цисплатина клітинах іноді спостерігається гіперекспресія гена mdm 2

[87] а використання антисмислових (проти mdm 2) нуклеотидів у такій

системі призводить до збільшення чутливості до лікарської терапії

[88].

Таким чином, функція Р 53 може бути інактивована двома шляхами:

мутаціями безпосередньо гена р 53 а також підвищеним

комплексоутворенням Р 53 з MDM 2.

Але дані деяких досліджень заперечують, що мутації р 53

обов`язково спричиняють розвиток лікарської резистентності. Feudis з

співавторами показали, наприклад, на 9 клітинних лініях раку яєчника

з різним р 53- статусом, що в цих клітинних лініях після обробки

цисплатином рівень експерсії р 21 підвищується однаковo і немає

різниці у чутливості до апоптозу, індукованого дією препарата

[89,90].

Однак відомо, що більш половини злоякісних новоутворень людини

відрізняються мутаціями р 53, i ця ознака є важливим показником

чутливості пухлин до хіміотерапії [91]. У клінічних дослідженнях

показано, що рівень експресії р 53 у зразках біопсійного матеріала

при раку шлунка та яєчників може бути важливим прогностичним

показником захворювання [92]. Досліджено, що Р 53-позитивний фенотип

пухлин асоціюється з поганим прогнозом [93,94]. Це пояснюється тим,

що мутантна форма білка має подовшений час напівжиття і тому легше

виявляється імуногістохімічно.

Білки родини Bcl (Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-Xs, Bax та інші) грають

важливу роль у регуляції процесу апоптоза. Деякі з них (Bcl-Xl, Bcl-

2) гальмують розвиток апоптоза, тоді як інші (Bcl-Xs, Bax, Bak) –

навпаки є промоторами цього процесу. Відомо, що білки даної родини

здатні гетеродимеризуватись, утворюючи умовний “реостат”, який

регулює функціональну активність білків [95]. Досліджено, що білки

Bcl-2 та Bcl-Xl гіперекспресовані при багатьох неопластичних

захворюваннях людини. Причому така гіпрекспресія асоційована з

резистентністю пухлинних клітин in vitro до протипухлинних препаратів

[96]. Така стійкість клітин пов`язана з порушенням механізмів

індукції апоптозу у відповідь на лікарську терапію. У дослідах з

використанням клітин траксфекованих генами bcl-2 чи bcl-xl було

показано, що трансфекти набувають резистентний фенотип до цілого ряду

лікарськиї препаратів включаючи цисплатин [97,98]. У таких модельних

клітинах була значно зменшена деградація ДНК після обробки

цисплатином. Якщо порівнювати внесок продуктів генів bcl-2 та bcl-xl

у антиапоптозному ефекті, то показано, що білок Bcl-Xl має більший

вплив [99].

Після обробки цисплатином у чутливих клітинах, що входять в

апоптоз, не змінюється рівень експресії білків Bcl-2, Bcl-Xl та Bax

(24kDa), але підвищується рівень білків Bak та Bax (21 kDa), тобто

білків-агоністів апоптозау [100-102]. Відомо, що в деяких

резистентних до цисплатина клітинних лініях спостерігається знижений

рівень експресії Bax [103], а трансфекція гена bax спричиняє

підвищення чутливості до хіміотерапії [104]. А от клітини з

підвищеною експресією Bak відрізняються більшою чутливістю до дії

цисплатина [105].

Відомо, що білок Bcl-2 часто гіперекспресований у пухлинах людини. Причиною

такої гіперекспресії вважають часті ділеції великих нетрансльованих

послідовностей з 3 та 5 – кінців гену bcl-2 (78-А). Дещо суперечливі дані

імуногістохімічних досліджень експресії білків родини Bcl у зразках

біопсійного матеріалу та прогнозування чутливості до лікарської

терапії у порівнянні з дослідженнями in vivo. Наприклад, одні

дослідники повідомляють, що Вcl-2-позитивні неоплазії мають слабку

відповідь на хіміотерапію та поганий прогноз [106,107], інші –

навпаки, спостерігають, що експресія Вcl-2 у пухлинах асоціюється з

покращеним виживанням [108]. Експресія Вax окремо не має ніякого

прогностичного значення [109].

Роботи, зроблені з використанням резистентних до дії цисплатина

лініях клітин показали важливість онкогена fos в резистентності до

цього препарату. В резистентних лініях клітин спостерігали підвищений

рівень експресії гена fos. Були визначені дві важливі функції Fos-

білка: транскрипційна активація синтеза ДНК та участь у клітнинній

проліферації. Fos-білок контролює клітинну відповідь на пошкодження

ДНК цисплатином через активацію генів топоізомерази І, полімерази ?

та металотеонеіна [2].

Повідомляється про те, що гіперекспресія супресорного гена nm

23 супроводжується, як правило, збільшенням чутливості до дії

цисплатина. Дані результати отримано з досліджень in vitro на

клітинних лініях карциноми молочної залози людини MDA-MB-435, лінії

карциноми яєчника OKAR-3 та лінії меланоми К-1735-ТК, а також при

дослідженні клінічного матеріалу пухлин молочної залози. У всіх

досліджуваних системах гіперекспресія nm 23 призвела до формування у

клітинах великої кількості міжланцюгових зшивок ДНК та збільшення

чутливості до цисплатина [110].

Цікавими є дані по переносу резисткнтного до цисплатина

фенотипу при трансфекції генів v-src. Непухлинні епітеліальні клітини

людини HAG-1 після трансфекції гену v-src набували неопластичного

фенотипу та резистентності до цисплатина. У трансформованих клітинах

спостерігали значне зменьшення формування міжланцюгових зшивок ДНК з

їх послідовним швидким видаленням. Після обробки даних клітин

інгібіторами src-кіназ знижувався рівень резистентності до

Страницы: 1, 2, 3