Генная инженерия

Рис. 3. Принцип сортировки хромосом с помощью лазера. Хромосомы

окрашены флуоресцирующим красителем. Флуоресценция возбуждается лазерным

лучом и измеряется для каждой хромосомы отдельно. Данные измерений

используют для сортировки хромосом.

1.7. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК.

Последовательность нуклеотидов и генетический код.

Методы определённой последовательности аминокислот в полипептидной цепи

были известны ещё в 50-х годах. Теоретически это относительно лёгкая

проблема, поскольку все 20 аминокислот, встречающихся в природных белках,

имеют разные свойства. С другой стороны, нуклеотидная последовательность

ДНК относительно однородна по составу однородных звеньев, так как содержит

только четыре типа азотистых оснований – гуанин, цитозин, аденин и тимин.

Когда в 60-е годы был расшифрован генетический код, появилась возможность

востанавливать (дедуцировать) нуклеотидную последовательность

соответствующего белка. Однако генетический код является вырожденным, то

есть одной и той же аминокислоте соответствуют несколько нуклеотидных

триплетов. Следовательно сведения о нуклеотидной последовательности

аминокислот в белке, не однозначны. Кроме того последовательности

аминокислот не содержат никакой информации о последовательности

некодирующих участков ДНК. Принцип состоит в следующем: длинную молекулу

ДНК фрагментируют при помощи агентов, расщепляющихся в специфических

сайтах. Затем определяют последовательность нуклеотидов в каждом из этих

фрагментов. Очерёдность фрагментов в целой молекуле восстанавливают,

используя перекрывающие концы: идентичные цепи разрезают повторно другой

рестриктазой, а затем последовательности, перекрывающихся образующихся при

обработке двумя рестриктазами разной специфичности, сравнивают. Так может

быть реконструирована полная последовательность. В пределах отдельных

фрагментов порядок нуклеотидов определяют с помощью специальных методов.

Раньше секвенирование ДНК было весьма трудным делом, теперь же оно

осуществляется очень легко и быстро. Для этого необходимо длинную молекулу

ДНК с помощью рестриктазы разделить на фрагменты удобного размера, а затем,

если нужно,мощью специальных методов. Раньше секвенирование ДНК было весьма

трудным делом, теперь же оно осуществляется очень легко и быстро. Для этого

необходимо длинную молекулу ДНК с помощью рестриктазы разделить на

фрагменты удобного размера, а затем, если нужно,ные сведения и о

нетранскрибирусных участках ДНК, важных для контроля транскрипции(так

называемые операторы и промоторы).

1.8.ДИНАМИЧНОСТЬ ГЕНОМА.

Методы новой гентики расширили наши знания о структуре генетического

материала. В 1963 году Тэйлор описал “индуцированные фагом мутации E.

Coli”, вкоре после этого, Старлингер и Седлер описали IS-элементов у

бактерий. Эти элементы получили название мобильных, теперь же они

определяются как специфические последовательности ДНК, которые могут

неоднократно внедряться в разные сайты генома. Перенос генов от одной

бактерии к другой с помощью фага (трансдукция) известен давно, а теперь

используется и в генетической инженерии эукариот (включая клетки

млекопитающих). Возможно, такие процессы могут происходить и в природе.

Более того, последовательности ДНК, гомологичные глобиновому гену человека,

были обнаружены у бобовых растений. Функция такого гена у растений может

состоять в том, чтобы “обеспечить кислородом клубеньковые бактерии в

ткани”. Наличие этого гена может быть объяснено переносом его от насекомых

или млекопитающих.(рис.4).

Стр 142 рис 2.95

НАРИСУЕМ САМИ

Итак, из выше изложенного можно сделать следующее заключение, что

теоретическими предпосылками формирования генной инженерии как науки,

явились:

1. Открытие двойной спирали ДНК.

1. Получение информации о матричном синтезе:

3. Репликации ДНК.

4. Транскрипции ДНК.

5. Трансляции ДНК.

3. Открытие плазмид.

4. Открытие фрагментов рестриктаз.

5. Осуществление процесса рекомбинации хромосом

6. Идентификация и анализ генов.

6. Способность к гибридизации цепей ДНК.

6. Секвенирование ДНК.

ГЛАВА 2. ВОЗМОЖНОСТИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ.

Значительный прогресс достигнут в практической области создания новых

продуктов для медицинской промышленности и лечения болезней человека

(табл.2).

ТАБЛИЦА 2.

Использование генно-инженерных продуктов в медицине.

|Продукт |Природные продукты и сфера применения |

| |генно-инженерных продуктов |

|Антикоагуляторы|Активатор тканевого плазминогена (АТП), активирует |

| |плазмин. Фермент, вовлечённый в рассасывание |

| |тромбов; эффективен при лечении больных инфарктом |

| |миокарда. |

|Факторы крови |Фактор VIII ускоряет образование сгустков; дефицитен|

| |у гемофиликов. Использование фактора VIII, |

| |полученного генно-инженерными методами, устраняет |

| |риск связанный с переливанием крови. |

|Факторы |Ростовые факторы иммунной системы, которые |

|стимулирующие |стимулируют образование лейкоцитов. Применяют для |

|образование |лечения иммунодефицита и борьбе с инфекциями. |

|колоний | |

|эритропоэтин |Стимулирует образование эритроцитов. Применяют для |

| |лечения анемии у больных с почечной |

| |недостаточностью. |

|Ростовые |Стимулируют дифференциацию и рост различных типов |

|факторы |клеток. |

| |Применяют для ускорения лечения ран. |

|Гормон роста |Применяют при лечении карликовости. |

|человека | |

|Человеческий |Используется для лечения диабета |

|инсулин | |

|Интерферон |Препятствует размножению вирусов. Также используется|

| |для лечения некоторых форм раковых заболеваний. |

|Лейксины |Активируют и стимулируют работу различных типов |

| |лейкоцитов. Возможно применение при залечивании ран,|

| |при заражении ВИЧ, раковых заболеваний, |

| |иммунодефиците. |

|Моноклональные |Высочайшая специфичность связанная с антителами |

|антитела |используется в диагностических целях. применяют |

| |также для адресной доставки лекарств, токсинов, |

| |радиоактивных и изотопных соединений к раковым |

| |опухолям при терапии раков, имеется много других |

| |сфер применения. |

|Супероксид |Предотвращает поражение тканей реактивными |

|дисмутаз |оксипроизводными в условиях кратковременной нехватки|

| |кислорода, особенно в ходе хирургических операций, |

| |когда нужно внезапно восстановить ток крови. |

|Вакцины |Искуственно полученные вакцины (первой была получена|

| |вакцина против гепатита В) по многим показателям |

| |лучше обычных вакцин. |

В настоящее время фармацевтическая промышленность завоевала лидирующие

позиции в мире, что нашло отражение не только в объёмах промышленного

производства, но и в финансовых средствах, вкладываемых в эту

промышленность (по оценкам экономистов, она вошла в лидирующую группу по

объёму купли-продажи акций на рынках ценных бумаг). Важной новинкой стало и

то, что фармацевтические компании включили в свою сферу выведение новых

сортов сельскохозяйственных растений и животных, и тратят на это десятки

миллионов долларов в год, они же мобилизировали выпуск химических веществ

для быта. Добавок к продукции строительной индустрии и так далее. Уже не

десятки тысяч, а возможно, несколько сот тысяч высококвалифицированных

специалистов заняты в исследовательских и промышленных секторах

фарминдустрии,и именно в этих областях интерес к геномным и генно-

инженерным исследованиям исключительно высок.

Очевидно поэтому любой прогресс биотехнологий растений будет зависеть

от разработки генетических систем и инструментов, которые позволят более

эффективно управлять трансгенами. Ситуация аналогична той, которая

наблюдается в компьютерной индустрии, где помимо увеличения объёмов

обрабатываемой информации и улучшения самих компьютеров, нужны ещё и

операционные системы управления информацией, типа микрософтовских “окон”.

Для чистого вырезания трансгенного ДНК в растительный геном, всё больше

применяют заимствованные из микробной генетики системы гомологичной

рекомбинации, такие как системы Cre-lox и Flp-frt. Будущее, очевидно, будет

за управляемым переносом генов от сорта к сорту, основанного на применении

предварительно подготовленного растительного материала, который уже

содержит в нужных хромосомах участки гомологии, необходимого для

гомологичного встраивания трангена. Помимо интегративных систем экспрессии,

будут опробованы автономно реплицирующиеся векторы.осбый интерес

представляют искуственные хромосомы растений, которые теоретически не

накладывают никаких ограничений на объём вносимой теоретической информации.

Кроме этого учёные занимаются поиском генов, кодирующих новые полезные

признаки. Ситуация в этой области меняется радикальным образом, прежде

всего, существованию публичных баз данных, которые содержат информацию о

большинстве генов, бактерий, дрожжей, человека и растений, а также в

следствии разработки методов, позволяющих одновременно анализировать

экспрессию большого количества генов с очень высокой пропускной

способностью. Применяемые на практике методы можно разделить на две

категории:

1. Методы, позволяющие вести экспрессионное профилирование:

субстракционная гибридизация, электронное сравнение EST-библиотек,

«генные чипы» и так далее. Они позволяют устанавливать корреляцию

между тем или иным фенотипическим признаком и активностью конкретных

генов.

2. Позиционное клонирование, заключается в создании за счет

инсерционного мутагенеза мутантов с нарушениями в интересующем нас

признаке или свойстве, с последующим клонированием соответствующего

гена как такового, который заведомо содержит известную

последовательность (инсерция).

Вышеназванные методы не предполагают ни каких изначальных сведений о

генах, контролирующих тот или иной признак. Отсутствие рационального

компонента в данном случае является положительным обстоятельством,

поскольку неограничен нашими сегодняшними представлениями о природе и

генном контроле конкретного интересующего нас признака.

Кроме всего этого группа ученых, таких как Марк Адам (ведущий сотрудник

института геномных исследований в штате Мэриленд – США, частной

исследовательской компании, занимающейся исключительной работой в области

картирования генов), Крэйк Вентер (директор этого института) и соавторами,

разрабатывается проект «Геном человека». Цель этого проекта заключается в

выяснении последовательности оснований во всех молекулах ДНК в клетках

человека. Одновременно должна быть установлена локализация всех генов, что

помогло бы выяснить причину многих наследственных заболеваний и этим

открыть пути к их лечению. Что бы последовательно приближаться к решению

проблемы картирование генов человека, было сформулировано пять основных

целей:

1) Завершить составление детальной генетической карты, на которой были

бы помечены гены, отстоящие друг от друга на расстоянии не

превышающем в среднем 2 млн. оснований (1 млн. оснований принято

называть мегобазой);

2) составить физические карты каждой хромосомы (разрешение 0.1 Мб);

3) получить карту всего генома в виде охарактеризованных клонов (5 тыс.

оснований в клоне или 5 Кб);

4) завершить к 2004 году полное секвенирование ДНК (разрешение одного

основание);

5) нанести на полностью завершенную секвенсовую карту все гены человека

(к 2005 году).

Ожидалось, что, когда все указанные цели будут постигнуты,

исследователи определят все функции генов и разработают методы

биологического и медицинского применения полученных данных.

Рассмотрев темпы ускорения работы в рамках проекта «Геном человека»,

руководители этого проекта объявили 23 октября 1998г., что программа будет

полностью завершена гораздо раньше, чем планировалось, и сформулировали

«Новые задачи проекта «Геном человека»:

1) полностью завершить в декабре 1998 года работу по секвенирование

генома «Круглого червя» c. elegans (это было сделано в срок);

2) закончить предварительный анализ последовательности ДНК человека к

2001 году, а полную последовательность к 2003 году;

3) картировать к 2002 году геном плодовой мухи;

4) начать секвенирование генома мыши с использованием методов ДНК

искусственных хромосом дрожжей (завершить этот проект к 2005 году).

Помимо этих целей, официально включен в поддерживаемый правительством

США и рядом других правительств проект, некоторые исследовательские центры

объявили о задачах, которые будут решаться в основном за счет частных

фондов и пожертвователей. Так, ученые калифорнийского университета

(Беркли), Орегонского университета и Ракового исследовательского центра

имени Фрейда Хатчинсона начали программу «Геном собаки».

Международное общество секвенирование в феврале 1996 года приняло

решение о том, что любая последовательность нуклиотидов размером 1-2 Кб

должна быть обнародована (через Интернет) в течение 24 часов после ее

установления.

2.1. ЧТО БУДЕТ СДЕЛАННО ПОСЛЕ ЗАВЕРШЕНИЯ АНАЛИЗА ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА.

Главная стратегическая задача будущего сформулирована следующим

образом: изучить однонуклеотидные вариации ДНК в разных органах и клетках

отдельных индивидуумов и выявить различия между индивидуумами. Анализ таких

вариаций даст возможность не только подойти к созданию индивидуальных

генных портретов людей, что в частности даст возможность лечить болезни, но

и определить различия между популяциями. А также выявлять географические

районы повышенного риска, что поможет давать чёткие рекомендации о

необходимости очистке территории от загрязнения и выявить производства, на

которых есть большая опасность поражение геномов персонала.

Эта грандиозная задача рождает не одни радужные ожидания всеобщего

блага, но и вполне осознанную тревогу юристов и борцов за индивидуальные

права человека. Так, в частности, высказываются возражения против

распространения персональной информации без решения тех, кого она касается.

Один пример помогает понять эти тревоги: уже сейчас страховые компании

нацелились на добывание таких сведений правдами и неправдами, они

намериваются использовать данные против тех, кого они страхуют. Например,

если подающий на страховку несёт потенциально болезнетворный ген, компании

не хотят страховать таких людей вовсе или же пытаются заломить бешенные

суммы за их страховки. Исходя из этого, .конгресс США уже принял ряд

законов, направленный на строгий запрет распространения генетической

информации относительно отдельных людей, юристы всего мира интенсивно

работают в данном направлении.

Глава 3. Области практического применения генной инженерии.

3.1. Создание трансгенных растений.

Еще 10 лет тому назад биотехнология растений заметно отставала в своем

развитии, но за последние 3 года наблюдается быстрый выброс на рынок

трансгенных растений с новыми полезными признаками. Трансгенные растения в

США в 1996 году занимали площадь 3 млн. акров, в 1997 году площадь

увеличилась до 15 млн. акров, в 1998 году – до 60 млн. акров, а в прошлом

году до 80 млн. акров. Поскольку основные трансгенные формы кукурузы, сои,

хлопчатника с устойчивостью к гербицидам и насекомым хорошо себя

зарекомендовали, есть все основания ожидать, что площадь под генноиженерные

растения в будущем (2001 году) увеличатся в 4-5 раз.

В апреле 1998 года доля в процентах трансгенных форм растений в

сельском хозяйстве составило:

- кукуруза – 6

- соя – 12

- хлопчатник – 15

- томаты – <1

Так как число жителей за последнее столетие увеличилось с 1.5 до 5.5

млрд. человек, а к 2020 году предполагается вырост до 8 млрд., таким

образом возникает огромная проблема, стоящая перед человечеством. Эта

проблема заключается в огромном увеличение производства продуктов питания,

несмотря на то, что за последние 40 лет производство увеличилось в 2.5

раза, все равно этого не достаточно. И в мире в связи с этим наблюдается

социальный застой, который становится все более настоятельным. Другая

проблема возникла с медицинским лечением. Несмотря на огромные достижение

современной медицины, производимые сегодня лекарственные препараты столь

дороги, что ѕ населения земли сейчас полностью полагаются на традиционные

донаучные методы лечения, прежде всего на неочищенные препараты

растительного происхождения.

В развитых странах лекарственные средства на 25% состоят из природных

веществ, выделенных из растений. Открытия последних лет (противоопухолевые

препараты: таксол, подофиллотоксин) свидетельствуют о том, что растения еще

долго будут оставаться источником полезных биологически-активных веществ

(БТА), и что способности растительной клетки к синтезу сложных БТА все еще

значительно превосходят синтетические способности инженера-химика. Вот

почему ученые взялись за проблему создания трансгенных растений.

Отсчёт истории генетической инженерии растений принято вести с 1982

года, когда впервые были получены генетически трансформированные растения.

Страницы: 1, 2, 3, 4