Биотехнология

антибиотиков. Значительных результатов удалось добиться за десятилетия

селекции штаммов-продуцентов с применением индуцированного мутагенеза и

ступенчатого отбора. Например, продуктивность штаммов Penicillium по

синтезу пенициллина увеличена в 300—350 раз. Определенные перспективы

открываются в связи с возможностью клонирования генов «узких мест»

биосинтеза антибиотика или в случае, если все биосинтетические ферменты

кодируются единым опероном.

Многообещающим подходом служит инкапсулирование антибиотиков, в частности

их включение в лигюсомы, что позволяет прицельно доставлять препарат только

к определенным органам и тканям, повышает его эффективность и снижает

побочное действие. Этот подход применим и для других лекарственных

препаратов. Например, кала-азар, болезнь, вызываемая лейгшма-нией,

поддается лечению препаратами сурьмы. Однако лечебная доза этих препаратов

токсична для человека. В составе липосом препараты сурьмы избирательно

доставляются к органам, пораженным лейшманией, — селезенке и печени.

Вместо антибиотика в организм человека может вводиться его продуцент,

антагонист возбудителя заболевания. Этот подход берет начало с работ И.

И.Мечникова о подавлении гнилостной микрофлоры в толстом кишечнике человека

посредством молочнокислых бактерий. Важную роль в возникновении кариеса

зубов, по-видимому, играет обитающая во рту бактерия Streptococcus mutans,

которая выделяет кислоты, разрушающие зубную эмаль и дентин. Получен мутант

Strept. mutans, который при введении в ротовую полость почти не образует

коррозивных кислот, вытесняет дикий патогенный штамм и выделяет летальный

для него белковый продукт.

Гормоны.

Биотехнология предоставляет медицине новые пути получения ценных

гормональных препаратов. Особенно большие сдвиги произошли в последние годы

в направлении синтеза пеп-тидных гормонов.

Раньше гормоны получали из органов и тканей животных и человека (крови

доноров, удаленных при операциях органов, трупного материала). Требовалось

много материала для получения небольшого количества продукта. Так,

человеческий гормон роста (соматотропин) получали из гипофиза человека,

каждый гипофиз содержит его не более 4 мг. В то же время для лечения одного

ребенка, страдающего карликовостью, требуется около 7 мг соматотропина в

неделю; курс лечения должен продолжаться несколько лет. С применением

генноинже-нерного штамма Е. coli в настоящее время получают до 100 мг

гормона роста на 1 л среды культивирования. Открываются перспективы борьбы

не только с карликовостью, но и с низкорос-лостью — более слабой степенью

дефицита соматотропина. Соматотропин способствует заживлению ран и ожогов,

наряду с каль-цитонином (гормоном щитовидной железы) регулирует обмен Са2+

в костной ткани.

Инсулин, пептидный гормон островков Лангерганса поджелудочной железы,

представляет основное средство лечения при сахарном диабете. Эта болезнь

вызвана дефицитом инсулина и проявляется повышением уровня глюкозы в крови.

До недавнего времени инсулин получали из поджелудочной железы быка и

свиньи. Препарат отличался от человеческого инсулина 1—3 аминокислотными

заменами, так что возникала угроза аллергических реакций, особенно у детей.

Широкомасштабное терапевтическое применение инсулина сдерживалось его

высокой стоимостью и ограниченностью ресурсов. Путем химической модификации

инсулин из животных удалось сделать неотличимым от человеческого, но это

означало дополнительное удорожание продукта.

Компания Eli Lilly с 1982 г. производит генноинженерный инсулин на основе

раздельного синтеза Е. coli его А- и В-цепей. Стоимость продукта

значительно снизилась, получаемый инсулин идентичен человеческому. С 1980

г. в печати имеются сообщения о клонировании у Е. сой гена проинсулина —

предшественника гормона, переходящего в зрелую форму при ограниченном

протеолизе.

К лечению диабета приложена также технология инкапсули-рования: клетки

поджелудочной железы в капсуле, введенные однократно в организм больного,

продуцируют инсулин в течение года.

Компания Integrated Genetics приступила к выпуску фолли-кулостимулирующего

и лютенизирующего гормонов. Эти пептиды составлены из двух субъединиц. На

повестке дня вопрос о промышленном синтезе олигопептидных гормонов нервной

системы — энкефалинов, построенных из 5 аминокислотных остатков, и

эндорфинов, аналогов морфина. При рациональном применении эти пептиды

снимают болевые ощущения, создают хорошее

настроение, повышают работоспособность, концентрируют внимание, улучшают

память, приводят в порядок режим сна и бодрствования. Примером успешного

применения методов генетической инженерии может служить синтез р-эндорфина

по технологии гибридных белков, описанной выше для другого пептидного

гормона, соматостатина.

Значителен вклад биотехнологии и в промышленное производство непептидных

гормонов, в первую очередь стероидов. Методы микробиологической

трансформации позволили резко сократить число этапов химического синтеза

кортизона, гормона надпочечников, применяемого для лечения ревматоидного

артрита. При производстве стероидных гормонов широко используют

иммобилизованные микробные клетки, например Arthrobacter globiformis, для

синтеза преднизолона из гидрокортизона. Имеются разработки по получению

гормона щитовидной железы тироксина из микроводорослей.

Интерфероны, интерлейкины, факторы крови.

Интерфероны выделяются клетками человека и животных в ответ на инфици-

рование вирусами. Они обладают антивирусной активностью. Механизм действия

интерферонов до конца не выяснен. Предполагается, в частности, что

Интерфероны препятствуют проникновению вирусных частиц в клетку.

Интерфероны стимулируют деятельность иммунной системы и препятствуют

размножению клеток раковых опухолей. Все аспекты действия интерферонов

важны с точки зрения их терапевтического применения.

Различают ?-, ?-, ?- и (-интерфероны, образуемые соответственно

лейкоцитами, фибробластами соединительной ткани, Т-лимфоцитами и

эпителиальными клетками. Наибольшее значение имеют первые три группы.

Интерфероны состоят из 146—166 аминокислотных остатков, ? - и ?-интерфероны

связаны с остатками Сахаров (гликозилированы). До введения методов

генетической инженерии интерфероны получали из донорской крови — до 1 мкг

неочищенного интерферона из 1 л крови, т. е. примерно одну дозу для

инъекции.

В настоящее время ?-, ?- и ?-интерфероны успешно получают с применением

генноинженерных штаммов Е. coli, дрожжей, культивируемых клеток насекомых

(Drosophil?) и млекопитающих. Генно-инженерные интерфероны могут быть

очищены с использованием моноклональных антител. В случае у- и р-

интерферонов предпочтительно применение эукариотических продуцентов, так

как прокариоты не гликозилируют белки. Некоторые фирмы, например Bioferon

(ФРГ), используют не генноинженерные мутанты, а культивируемые in vitro

фибропласты человека.

Интерфероны используются для лечения болезней, вызываемых вирусами герпеса,

бешенства, гепатитов, цитомегаловиру-сом, вирусом, вызывающим опасное

поражение сердца, а также для профилактики вирусных инфекций. Вдыхание

аэрозоля интерферонов позволяет предупредить развитие острых респираторных

заболеваний. Несколько курьезной проблемой является то что интерфероны, в

частности ?-интерфероны, сами могут вызывать у пациентов простудные

симптомы (насморк, повышение температуры и т.д.). Проблема побочного

действия стоит особенно остро при длительном терапевтическом применении

интерферонов, необходимом для лечения злокачественных опухолей.

Интерфероны оказывают лечебное воздействие на организм больных раком груди,

кожи, гортани, легких, мозга, рассеянной миеломе и саркоме Капоци — два

последних заболевания характерны для лиц, страдающих приобретенными

иммунодефицитами (см. ниже). Интерфероны полезны также при лечении

рассеянного склероза.

Методы генетической инженерии позволяют получать модифицированные

Интерфероны. Антивирусная активность интерферонов варьирует при

аминокислотных заменах (J. Werenne, 1983). Американская компания Cetus

Corporation производит ?-интер-ферон, в аминокислотной последовательности

которого цистеин в положении 17 замещен на серии. Это приводит к повышению

терапевтической активности препарата, так как предотвращает наблюдаемое in

vitro формирование неактивного димера ?-интер-ферона за счет дисульфидных

связей между остатками цистеина в положении 17. Определенные надежды

возлагают на модификацию интерферонов путем получения гибридных молекул (Е.

Д. Свердлов, 1984).

Интерлейкины—сравнительно короткие (около 150 аминокислотных остатков)

полипептиды, участвующие в организации иммунного ответа. Интерлейкин-1,

образующийся определенной группой лейкоцитов крови — макрофагами, в ответ

на введение антигена стимулирует размножение (пролиферацию) Т-хелперов

(субпопуляции Т-лимфоцитов), продуцирующих, в свою очередь, интерлейкин-2.

Последний вызывает пролиферацию различных субпопуляций Т-лимфоцитов — Т-

киллеров, Т-хелперов, Т-супрессоров, а также В-лимфоцитов, продуцентов

антител. Под влиянием интерлейкина-2 из Т-лимфоцитов высвобождаются

регуляторные белки — лимфокины, активирующие звенья иммунной системы;

синтезируются также Интерфероны.

Интерлейкины, основные лечебные средства при иммунных расстройствах,

получают путем клонирования соответствующих генов в Е. coll или

культивирования лимфоцитов in vitro. Английская компания Celltech Ltd и

японская Sakyo Company предлагают синтезированный генноинженерными

бактериями интерлей-кин-1 наряду с другим тюлипептидным агентом —фактором

некроза опухолей -- для лечения ряда опухолевых заболеваний (В. Sikyta el

al., 1986).

Получаемые биотехнологическим путем факторы свертывания крови, особенно

фактор VIII (с помощью культивируемых клеток млекопитающих) и фактор IX (с

помощью генноинженер-ного штамма Е. coli), необходимы для терапии форм

гемофилии наследственной болезни, при которой кровь теряет способность

свертываться. К числу ценных с клинической точки зрения факторов,

полученных в биореакторах с культурами животных клеток, следует отнести

фактор роста В-лимфоцитов, фактор активации макрофагов, Т-заместительный

фактор, активатор тканевого плазминогена.

Моноклокальные антитела и ДНК-или РНК-пробы.

Моноклональные антитела — продукты В-гибридомных клеток — используют для

диагностики различных заболеваний. Обладая высокой специфичностью действия,

они обеспечивают идентификацию не только вида возбудителя, но и его

серотипа. С помощью моноклональных антител можно тестировать различные

гормоны, метаболиты, белковые факторы. Наиболее быстрый метод индикации

основан на применении антител, иммобилизованных на мембранных электродах —

аналогах ферментных биосенсоров. Они позволяют диагностировать

беременность, выявлять предрасположенность к диабету, ревматоидному артриту

(J. Col-lins et al., 1986), идентифицировать наследственные заболевания,

сопровождающиеся утратой тех или иных ферментов и других белковых

компонентов. Моноклональные антитела широко используют для диагностики рака

и определения его форм.

Трудности связаны с тем, что специфических «раковых» антигенов, по-

видимому, не бывает, и характерные для злокачественно переродившейся клетки

детерминанты могут быть с некоторой, пусть небольшой, вероятностью

обнаружены и в здоровых клетках. Перспективна диагностика рака при помощи

моноклональ-ных антител к вырабатываемым злокачественной опухолью особым

гормонам, аутокринам, ведущим к самостимуляции роста раковых клеток.

Моноклональные антитела имеют не только диагностическое, но и лечебное

значение. При аутоиммунных заболеваниях, когда иммунные клетки «ополчаются»

против собственных органов и тканей, моноклональные антитела

соответствующей специфичности могут связывать антитела, наносящие вред

организму больного. Для лечения рака предлагают использовать моноклональные

антитела, конъюгированные с токсичными для раковых клеток соединениями.

Моноклональные антитела доставляют яд точно по адресу, избегая поражения

здоровых клеток. Поэтому к моноклональным антителам можно присоединять

очень сильные токсины, например рицин — яд из клещевины, одной молекулы

которого достаточно для поражения одной клетки. В современной

фармацевтической промышленности моноклональные антитела используют для

очистки лекарственных препаратов.

Диагностическое значение имеют короткие фрагменты ДНК и РНК, несущие

радиоактивную или иную метку, так называемые ДНК/РНК-пробы. С их помощью

можно установить наличие в организме определенных типов нуклеиновых кислот,

соответствующих болезнетворным агентам, злокачественным опухолям, а также

проверить геном пациента на наличие у него тех или иных генетических

аномалий. Метод основан на комплементарном взаимодействии проб с участками

ДНК или РНК, выделенными из исследуемых клеток и фиксированными на

носителе. Взаимодействия нуклеотидных цепочек пробы с ДНК (РНК) из образца

регистрируют по радиоактивной метке или иным способом.

Моноклональные антитела и ДНК/РНК-пробы используют для диагностики болезней

животных и растений. В частности, с помощью этих проб проводят индикацию

зараженности картофеля вирусом. Диагностические средства из арсенала

биотехнологов предлагают применять для быстрого определения пола у цыплят.

Рекомбинантные вакцины и вакцины-антигены.

Вакцинация — один из основных способов борьбы с инфекционными

заболеваниями. Путем поголовной вакцинации ликвидирована натуральная оспа,

резко ограничено распространение бешенства, полиомиелита, желтой лихорадки.

На повестке дня — изготовление вакцин против гриппа, гепатитов, герпесов,

свинки, кори, острых респираторных заболеваний. Большое экономическое

значение имеет разработка вакцин против болезней сельскохозяйственных

животных — ящура, африканской болезни лошадей, овечьей бо-

лезни «синего языка», трипаносомозов и др. Традиционные вакцинные препараты

изготовляют на основе ослабленных, инактивиро-ванных или дезинтегрированных

возбудителей болезней.

Современные биотехнологические разработки предусматривают создание

рекомбинантных вакцин и вакцин-антигенов. Вакцины обоих типов основаны на

генноинженерном подходе.

Для получения рекомбинантных вакцин обычно используют хорошо известный

вирус коровьей оспы (осповакцины). В его ДНК встраивают чужеродные гены,

кодирующие иммуногенные белки различных возбудителей (гемагглютинин вируса

гриппа, гликопротеин D вируса герпеса, поверхностный антиген вируса

гепатита В, антиген малярийного плазмодия). Получаются вакцины против

соответствующих инфекций, хорошо зарекомендовавшие себя в опытах на

животных. К их достоинствам относится возможность создания поливалентных

вакцинных препаратов на основе объединения участков ДНК различных патогенов

«под эгидой» ДНК вируса осповакцины. Открывается возможность одномоментной

комплексной иммунизации, скажем, крупного рогатого скота против всех

опасных инфекций данной местности.

Вакцины-антигены получают, клонируя гены возбудителя болезни в Е. colt,

дрожжах, клетках насекомых и млекопитающих. Клонирован ген поверхностного

антигена HBS-вируса гепатита В (сывороточного гепатита), ген белка оболочки

УРЬвируса ящура. Вирус ящура существует в виде многих серотипов, методом

белковой инженерии удалось скомбинировать иммуногенные компоненты различных

серотипов в рамках одной вакцины-антигена.

Вакцины-антигены высокостабильны при хранении и перевозке, сравнительно

просты в изготовлении (в том числе и при крупномасштабном производстве),

содержат минимальное количество белка и поэтому малоопасны как аллергены.

Они гарантированы от остаточной инфекционности — способности вызывать

инфекционную болезнь вместо того, чтобы предохранять от нее. Проблемой

является низкая иммуногенность вакцин-антигенов. Одной из причин может быть

то, что вакцина не включает всех компонентов возбудителя, необходимых для

создания иммунитета к нему. Так, вирус, покидая клетку, часто «одевается»

ее мембраной. Компоненты этой мембраны, отсутствующие в генноинженерном

белке, могут обладать иммуноген-ными свойствами. К повышению иммуногенности

вакцин-антигенов ведет добавление адьювантов, иммобилизация вакцин на

носителях или их включение в липосомы.

Ферменты медицинского назначения.

Многообразно применение ферментных препаратов в медицине. Их используют для

растворения тромбов, лечения наследственных заболеваний (вместо

отсутствующих эндогенных ферментов), удаления не-

жизнеспособных, денатурированных структур, клеточных и тканевых

фрагментов, освобождения организма от токсических веществ

(Н. Ф. Казанская и др., 1984). Яркий пример-спасение

жизни больных с тромбозом конечностей, легких, коронарных

сосудов сердца при помощи громболитически.х ферментов

(стрсптокиназы, урокиназы). В СССР такие препараты созданы в

иммобилизованной форме под руководством Е. И. Чазова и И. В.

Березина. Ген урокнназы клонирован в бактериях (S. Prentis, 1984). В

современной медицине протеазы применяются для очистки очагов гнойно-

некротических процессов от патологических продуктов, а также для

лечения ожогов Лечение рака связано с использованием L-аспарагиназы,

кото рая лишает раковые клетки ресурсов необходимого для их раз вития

аспарагина, поступающего с током крови. Здоровые клетки в

отличие от раковых (некоторых типов) способны к

самостоятельному синтезу аспарагина.

Известно около 200 наследственных заболеваний, обуслов ленных дефицитом

какого-либо фермента или иного белкового фактора. В настоящее время делают

попытки лечения этих заболеваний с применением ферментов. Так, пытаются

лечить болезнь Готе, при которой организм не способен расщеплять,

глюкоцереброзиды (S. Prentis, 1984).

В последние годы все больше внимания уделяют ингибиторам

ферментов. Ингибиторы протеаз, получаемые из актино мицетов

(лейпептин, антипаин, химостатин и др.) и генноинже нерных штаммов Е.

coil (эглин) и дрожжей (?-1 антитрипсин) оказываются полезными при

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5