Атф индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах неокортекса крыс

значительное уменьшение Ca2+ транзиента на 40% ( 5% от контроля.

Последующие аппликации АТФ в бескальциевом растворе приводили к

последовательному уменьшению амплитуды [Ca2+]i транзиента и после

двух - трех последовательных аппликаций сигнал исчезал вообще

(рисунок 10). Такое уменьшение вероятно обусловлено истощением

внутриклеточных депо.

[pic]

1. Ингибирование захвата Ca2+ эндоплазматическим ретикулом тапсигаргином

(спецефическим блокатором Ca2+ насоса эндоплазматического ретикулума)

уменьшало [Ca2+]i транзиенты, вызванные приложением АТФ, на 63% ( 5%

для концентрации АТФ 100 мкМ АТФ (рис. 11). Как видно из рисунка 11

приложение тапсигаргина не влияло на базальный уровень Ca2+ в клетке.

1. Приложение кадмия в концентрации 50 мкМ, верапамила в концентрации

100 мкМ и 50 мкМ никеля обратимо уменьшало амплитуду [Ca2+]i

транзиента вызванного приложением 100 мкМ АТФ на 35%, 20%, и 15%

сответственно. Данные представлены на рисунке 12.

[pic]

1. Приложение различных агонистов пуринорецепторов вызывало различные по

амплитуде ответы. Порядок относительной активности лигандов для

данного объекта был следующим ATP(S ( ATФ ( AДФ (( (,(-methylene ATP

( AMФ ( УТФ(( аденозин (ADO), данные преставлены на рисунке 13.

[pic]

1. Сурамин, известный антагонист Р2 типа пуринорецепторов, уменьшал

[Ca2+]i транзиенты, вызванные приложением 100 мкМ АТФ на 76% ( 7% и

также не изменял концентрацию [Ca2+]i в покое. Данные представлены

на рисунке 14.

[pic]

ОБСУЖДЕНИЕ

При исследовании средних слоев неокортекса крыс мы обнаружили их

способность отвечать на приложение АТФ. Таким образом мы можем сделать

вывод о наличии в данном объекте пуринорецепторов. Ответ на АТФ является

доза - зависимым с амплитудой половинного ответа в 220 нМ. Последовательные

приложения АТФ, после второго приложения, не вызывали уменьшения амплитуды

[Ca2+]in транзиентов. Из этого можно сделать вывод об отсутствии

десенситизации данного типа рецепторов.

Исследуя источники повышения цитозольного кальция мы обнаружили, что

АТФ активирует как ионотропные так и метаботропные рецепторы. Блокаторы

потенциал - управляемых кальциевых каналов такие как кадмий, никель и

верапамил уменьшали АТФ - индуцированные кальциевые транзиенты на 35% -

15%, что говорит об опосредованном АТФ активировании потенциал -

управляемых каналов.

Для исследования активацию метаботропных рецепторов. Для этого мы

прилагали АТФ в бескальциевом растворе, - амплитуда ответа при этом

уменьшалась на 45% ( 7%. Этот результат говорит о том, что внутриклеточные

депо принимают участие в генерации [Ca2+]in ответов, причем их вклад близок

к половине. При повторных аппликациях АТФ в бескальциевом растворе Ca2+

ответ исчезал полностью после второй аппликации, т.е. внутриклеточные депо

полностью истощаются. Исследуя путь высвобождения внутриклеточного кальция

мы апплицировали тапсигаргин - спецефический блокатор АТФ - азы

эндоплазматического ретикулума. [Ca2+]in транзиенты уменьшались на 63% ( 5%

в присутствии тапсигаргина. Аппликация коффеина, агониста рианодиновых

рецепторов, в клетках моторной коры 14 дневных крыс не вызывали повышения

уровня [Ca2+]in . Следовательно выброс [Ca2+]in из внутриклеточного депо

происходит по IP3 - чувствительному механизму.

В дальнейшем мы исследовали более подробно типы присутствующих

пуринорецепторов. Построив ряд активности агонистов для Р1 и Р2

пуринорецепторов по амплитудам ответов, мы сделали заключение базирующееся

на отсутствии ответа на аденозин, что в нашем объекте присутствуют только

Р2 пуринорецепторы. Проводя дальнейшую субклассификацию Р2 типа рецепторов

мы использовали сурамин - блокатор некоторых типов Р2х и Р2у рецепторов.

Приложение сурамина уменьшало амплитуду [Ca2+]i транзинета вызванного

приложением 100 мкМ АТФ на 76% ( 5%, что говорит о наличии этих типов

рецепторов в исследуемом объекте.

ВЫВОДЫ

1. Приложение АТФ в различных концентрациях вызывает Ca2+ транзиенты в

клетках моторной коры крыс.

2. Ответ на АТФ является доза - зависимым с амплитудой половинного ответа в

220 нМ.

3. АТФ активирует как ионотропный так и метаботропные пути повышения

внутриклеточного кальция.

4. В генерации АТФ индуцированного повышения [Ca2+]in принимают участие

некоторые типы потенциал - управляемых кальциевых каналов.

5. Высвобождение внутриклеточного кальция происходит из IP3 чувствительных

депо.

6. В данном объекте присутсвуют только Р2 подтипы пуринорецепторов.

7. Сурамин - антагонист Р2Х2 и Р2Х5 и Р2У рецепторов уменьшает амплитуду

[Ca2+]in транзиенты, что говорит присутствии некоторых из

вышеперечисленных рецепторов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. A.Shmigol, A.Verkhratsky & G. Isenberg (1995): Calcium-induced

calcium release in rat sensory neurones. Journal of Physiology

(London), 489.3 627-636.

2. A.Shmigol, G. Isenberg, P.Kostyuk & A. Verkhratsky (1994): Calcium-

induced Ca2+ release from internal stores in rat dorsal root

ganglion neurones. In: European Journal of Neuroscience, Suppl. 7,

Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting, p. 146.

3. A.Shmigol, N.Svichar, P.Kostyuk & A.Verkharatsky. (1995):

“Incremental” caffeine-induced calcium release in mouse sensory

neurones. European Joutnal of Neuroscience, Supple № 8. p111.

Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting.

4. A.Shmigol, Yu.Usachev, N.Pronchuk, S.Kirischuk, P.Kostyuk &

A.Verkhratsky (1994): Properties of the caffeine sensitive

intracellular calcium stores in mammalian neurons. Neurophysiology

/Neirophiziologia, v. 26 No. 2, p. 16 - 25.

5. A.Verkhratsky, A. Shmigol, S. Kirischuk, N. Pronchuk & P. Kostyuk

(1994): Age-dependent changes in calcium currents and calcium

homeostasis in mammalian neurons. Annals of the New York Academy

of Sciences, v. 747, p365 - 381.

6. Abbracchio, M. P., Burnstock, G. (1994) Purinoceptors: are there

families of P2x and P 2y purinoceptors? Pharmac. Ther. 64: 445-475

7. Anatoly Smigol, Platon Kostyuk, Alexey Verhratsky (1994) Role of

caffeine-sensitive Ca2+ stores in Ca2+ signal termination in adult

DRG neurones // NeuroReport v.5, 2073-2076.

8. Anatoly Smigol, Sergey Kirischuk, Platon Kostyuk, Alexey

Verhratsky (1994) Different properties of caffeine-sensitive Ca2+

stores in peripherial and central mammalian neurones // Pflugers

Arch v.426, 174-176.

9. Baker P. F., Blaustein M.P., Hodgkin A.L. and Steinhardt R. A. (1969)

The influence of calcium on sodium efflux in squid axons. J. Physiol.,

Lond. 200, 431-458.

10. Bean B.P. (1992) Pharmacology and electrophysiology of ATP-activated

ion channels. Trends Pharmacol. Sci. 13, 87 - 90.

11. Belan P., Kostyuk P., Snitsarev V. and Tepikin A. (1993) Calcium clamp

in isolated neurones of the snail Helix pomatia. J. Physiol., Lond.

462, 47 - 58.

12. Bronner, F. (1990). Intracellular Ca2+ regulation.. New York: Wiley-

Liss.

13. Burk S. E., Lytton J. , MacLennan D. H. and Shull G. E. (1989). cDNA

cloning, functional expressing, and mRNA tissue distribution of a third

organellar Ca2+ pump. J. Biol. Chem. 164, 18561-18568.

1. Burnstock, G. (1972) Purinergic nerves. Pharmacol. Rev. 24: 509-581

1. Burnstock, G. (1978) A basis for distinguishing two types of

purinergic receptor. in: book

1. Burnstock, G. (1990) Co-transmission. Arch. Int. Pharmacodyn. 304: 7-33

14. Burnstock, G., Kennedy, C.(1985) Is there a basis for distinguishing

two types of P2 purinoceptor? Gen.Pharmacol. 16: 433-440

15. Carafoli E. (1992) Calcium pump of the plasma membrane. Physiol. Rev.

71, 129 - 153.

16. Chen, C.-C., Akopian, A.N. et al, (1995) A P2x purinoceptors expressed

by a sybset of sensory neurones. Nature 377: 428 - 431

17. Кришталь О.А., Марченко С.М. (1983). Рецепторы АТФ в сенсорных нейронах

млекопитающих. Докл. Акад. Наук УССР.

18. Gianini G., Clementi E., Ceci R., Marziali G., and Sorremtino V. (1992)

Expression of a ryanodine receptor Ca2+ that is regulated by TGF-b,

Science, 257, 91 - 94.

19. Ginetta Collo et al, (1996) Cloning of P2X5 andP2X6 receptors and the

distribution and properties of an extended family of ATP-gated ion

channels. The J. of Neurosci. 16(8): 2495-2507

20. Gordon, J. L. (1986) Extracellular ATP: effects, sources and fate.

Biochem.J. 233: 309-319

21. Grynkiewicz, G., Poenie, M., and Tsien, R.Y. A new generation of Ca2+

indicators with greatly improved fluorescent properties. J. Biol.

Chem., 260, 3440-3450, 1985.

22. Heizmann C.W. and Hunziker W. (1991) Intracellular calcium-binding

proteins: more sights than insights. Trends Biochem. Sci. 16, 98 - 103.

23. Heschler J. and Schultz G. (1993) G-proteins involved in the calcium

channel signalling system. Curr. Opin. Neurobiol. 3, 360-367.

24. Hiderman, R. H., Martin, M., Zimmerman, J. K., Pivorun, E. B. (1991)

Identification of a unique membrane receptor for adenosin 5(,5(((-

P1,P4-tetraphosphate. J. Biol. Chem. 266: 6915-6918

25. Hoyle, C. H. V. (1990) Pharmacological activity of adenine

dinucleotides in the periphery: possible receptor classes and

transmitter function. Gen. Pharmacol. 21: 827-831

26. Hymel L., Inui M., Fleischer S. and Schindler H. (1988). Purified

ryanodine receptor of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum forms Ca2+-

activated oligomeric Ca2+ channels in planar bilayers.

Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85, 441-445.

27. Kirischuk S.I., Voitenko N.V., Kettenmann H.O. and Verkhratsky

A.N. (1994) Mechanisms of cytoplasmic calcium signalling in

cerebellar Bergman glial cells // Neurophysiology v.26, 417-419.

28. Kirischuk, V.Matiash, A.Kulik, N.Voitenko, P.Kostyuk,

A.Verkhratsky (1996) Activation of P2-purino, (1-adreno and H1-

histamine receptors triggers cytoplasmic calcium signalling in

cerebellar Pupkinje neurons // Neuroscience v.73, 643-647

29. Kostyuk and A. Verhratsky (1994) Calcium stores in neurones and

glia //Neuroscience v. 63, N.2, 381-404.

30. Kostyuk P. G. (1992). Calcium ions in nerve cell function. Oxford, New

York, Tokyo: Oxford University Press.

31. Kuno M., Maeda N. and Mikoshiba K. (1994) IP3-activated Ca2+-permeable

channels in the incide-out patches of cultured cerebellar Purkinje

cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 199, 1128 - 1135.

32. Lуckhoff A. and Clapham D.E. (1992) Inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate

activates an endothelial Ca2+-permeable channel. Nature 355, 356-358.

33. Londos, C., Cooper, D. M. F., Wolff, J. (1980) Subclasses of external

adenosine receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 2551-2554

34. Lytton J., Westlin M. and Hanley M. R. (1991). Thapsigargin inhibits

the sarcoplasmic or endoplasmic reticulum Ca-ATPase family of calcium

pums. Biol. Chem. 266, 17067-17071.

35. Mackgrill J. J. and Lai F. A. (1994). Solubilization of the type 3

ryanodine receptor from rabbit brain. Biophys. J. 66, A147

36. McPherson P. S., Kim Y. K., Valdivia H., Knudson C. M., Takekura H.,

Franzini-Armstrong C., Coronado R. and Campbell K. P. (1991). The brain

ryanodine receptor: A caffeine-sensitive calcium release channel.

Neuron 7, 17-25.

37. N.Voitenko, S.Kirischuk, A.Kulik, A.Verkhratsky (1995) Calcium

signalling in granule neurones of the mouse cerebellar slices //

Pflugers Archiv European Journal of Physiology, v.430, Supplement

4, R124.

38. Nicholls D.G. (1985) A role for the mitochondria in the protection of

the cell against calcium overload. Prog. Brain Res. 63, 97-106.

39. Pintor, J., Diaz-Rey, M. A., Torres, M., Miras-Portugal, M. T. (1992)

Presence of diadenosine polyphosphates-Ap4A and Ap5A-in rat brain

synaptic terminals. Ca2+-dependent release evoked by 4-aminopyridine

and veratridine. Neurosci. Lett. 136: 141-144

40. Ribeiro, J. A., Sebastiao, A. M. (1986) Adenosine receptors and

calcium: basis for proposing a third (A3) adenosine receptor. Prog.

Neyrobiol. 26: 179-209

41. Rios E. and Pizarro C. (1991) Voltage-sensor of excitation-contraction

coupling in skeletal muscle. Physiol. Rev. 76, 849 - 908

42. Ross C. A., Danoff S. K., Schell M. J., Snyder S. H. and Ullrich A.

(1992). Three additional inositol 1,4,5-trisphosphate receptors:

Molecular cloning and differential localization in brain and peripheral

tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 4265-4269.

43. S.Kirischuk, N.Voitenko, P.Kostyuk, A.Verkhratsky (1995) Calcium

signalling in granule neurones studied in cerebellar slices //

Cell Calcium v.18, 464-476

44. S.Kirischuk, N.Voitenko, P.Kostyuk, A.Verkhratsky (1996) Age-

associated Changes of Citoplasmic Calcium Homeostasis in

Cerebellar Granule Neurones in situ: Investigation on Thin

Cerebellar Slices. // Experimental Gerontology

45. S.Kirischuk, N.Voitenko, T.Moller, H.Kettenmann and A.Verkhratsky

(1995) ATP-induced cytoplasmic calcium mobilization in bergman

glial cells // J. Neuroscience v.15, 8234-8248.

46. Scheggerburger R., Zhou Z., Konnerth A. and Neher E. (1993). Fractional

contribution of calcium to the cation current through glutamate

receptor channels. Neuron 11, 133-143.

47. Sergej Kirischuk and Alexej Verkhratsky (1996) [Ca2+]i recordings

from neural cells in acutely isolated cerebellar slices employing

differential loading of the membrane-permeant form of the calcium

indicator fura-2 // Pflugers Arch. -Eur. J. Physiology v.431, 977-

983

48. Sergej Kirischuk, Nana Voitenko, Platon Kostyuk, Alexej

Verkhratsky (1996) Calcium signalling in granule neurones studied

in cerebellar slices // Cell Calcium v.19, 59-71

49. Shmigol A., Kirischuk S., Kostyuk P. and Verkhratsky A. (1994).

Different properties of caffeine-sensitive Ca2+ stores in peripheral

and central mammalian neurones. Pflьgers Arch. 426, 174-176.

50. Shmigol, D.Eisner & A.Verkhratsky (1995): Cyclic ADP ribose

enhances Ca2+-induced Ca2+ release in mouse sensory neurones.

Journal of Physiology, London, v. 483P, p63P.

51. Shmigol, N. Svichar, P. Kostyuk & A. Verkhratsky (1996) Gradual

caffeine-induced Ca2+ release in mice DRG neurones is controlled

by cytoplasmic and intraluminal Ca2+. Neuroscience, 73 N 4, 1061-

1067

52. Shmigol, P. Kostyuk & A. Verkhratsky (1995): Thapsigargin blocks

plasmalemmal voltage-operated calcium channels in mouse DRG

neurones. Journal of Physiology, London, v. 483P, p64P.

53. Soltoff, S. P., McMillian, M.K., Talamo, B.R., Cantley, L. C.(1993)

Blockade of ATP binding site of P2 purinoceptors in rat parotid acinar

cells by isothiocyanate compounds. Biochem. Pharmacol. 45: 1936-1940

54. Tatsumi H. and Katayama Y. (1993) Regulation of intracellular free

calcium concentration in acutely dissociated neurones from rat nucleus

basalis.J.Physiol., Lond.464,165-181.

55. Tepikin A. V., Kostyuk P. G., Snitsarev V. A. and Belan P. V. (1992a).

Extrusion of calcium from a single isolated neuron of the snail Helix

pomatia. J. Membrane Biol. 123, 43-37.

56. Thayer S.A. and Miller R.J. (1990) Regulation of the intracellular free

calcium concentration in single rat dorsal root ganglion neurones in

vitro. J.Physiol. (London), 425, 85 - 115.

57. Ursula Windscheif, (1996) Purinoceptors: from history to recent

progress. Review. J. Pharm. Pharmacol. 48: 993-1011

58. Van Calker, D., Muller, M., Hamprecht, B. (1979) Adenosine regulates

via two different types of receptors, the accumulation of cyclic AMP in

cultured brain cells. J. Neurochem. 33: 999-1005

59. Verkhratsky & A.Shmigol (1996) Calcium-induced calcium release in

neurones. Cell Calcium, v.19, No 1, 1-14.

60. Voitenko N., Kirischuk S., Verkhratsky A. (1995) Mechanisms of

cytoplasmic calcium signalling in cerebellar granule neurones in

situ. // Експериментальна та клінічна фізіологія, збірник наукових

праць до 100-річчя кафедри фізіології Львівського медичного

університету, р.357.

61. Zhou Z. and Neher E. (1993). Calcium permeability of nicotininc

acetylcholine receptor channels in bovine adrenal chromaffine cells.

Pflugers Arch. 425, 511-517.

62. Zhou Z. and Neher E. (1993). Mobile and immobile calcium buffers in

bovine adrenal chromaffin cells. J.Physiol., Lond. 469, 245-273.

-----------------------

Рисунок 1. Строение молекулы АТФ

Страницы: 1, 2, 3